發(fā)布時間：2020-07-05 19:53

【摘要】：糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管病變引起的腎小球硬化癥,隨著我國糖尿病患者人數(shù)的增加,DN的發(fā)病率也呈逐年增長的趨勢,其發(fā)病機制復雜,與基因、生活習慣及環(huán)境因素相關(guān),前期研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露會加速DN的發(fā)生,但其具體作用機制尚未闡明。葛根在治療糖尿病方面歷史悠久,且其諸多有效成分在現(xiàn)代藥理學研究中也展現(xiàn)出較好的生物活性,但葛根對鎘致糖尿病腎病的保護無相關(guān)報道。因此,本課題通過構(gòu)建DN模型,對比鎘(Cd)、高脂高糖飼料(HF)和鎘聯(lián)合高脂高糖飼料(HF+Cd)處理時小鼠的損傷效果,明確鎘和高脂高糖飲食在DN發(fā)生中的作用。給予DN小鼠不同劑量的葛根提取物,研究葛根提取物對DN保護的量效關(guān)系,確定最佳給藥量,結(jié)合組織形態(tài)學觀察驗證葛根提取物的保護效果�；�于代謝組學技術(shù)比較空白組、DN模型組和葛根提取物保護組的代謝物輪廓,篩選差異顯著的潛在生物標記物,結(jié)合生物信息學分析,探討葛根提取物保護的可能機制。結(jié)合Western blot技術(shù)和RT-PCR技術(shù),對DN的發(fā)病機制和葛根提取物可能保護途徑進行驗證。本課題旨在明確葛根提取物對鎘致糖尿病腎病的保護作用及其可能機制,為DN的臨床診斷和防治提供數(shù)據(jù)參考。具體研究如下:1.糖尿病腎病小鼠模型的構(gòu)建以及葛根提取物保護效果研究(1)鎘致糖尿病腎病損傷模型的驗證a.對生理指標數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),與Con組相比,HF+Cd組空腹血糖值升高60%(p0.05),飲食量、飲水量都發(fā)生大幅度升高,體重持續(xù)下降,符合糖尿病的“三多一少”臨床特征。b.對糖脂代謝水平研究發(fā)現(xiàn),與Con組相比,HF+Cd組的TC含量升高(p0.05),TG含量降低(p0.05),HDL極顯著降低70%(p0.001),LDL含量極顯著升高(p0.001)。c.對腎功能評價發(fā)現(xiàn),與Con組相比,HF+Cd組的腎臟系數(shù)、NAG、CER和BUN均發(fā)生極顯著升高(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001)。說明氯化鎘和高脂高糖飼料對小鼠均損傷作用,但二者聯(lián)合誘導時,HF+Cd組損傷效果加倍。(2)葛根提取物(GG)對DN小鼠保護效果研究a.對生理指標分析發(fā)現(xiàn),與DN組相比,保護組小鼠的飲水量、飲食量減少,體重回升,且空腹血糖接近K組,其中GG_M組的效果最明顯。b.對糖脂代謝水平研究發(fā)現(xiàn),與DN組相比,GG_M組的TC含量顯著降低(p0.01),HDL水平顯著升高(p0.01)。c.對腎功能評價發(fā)現(xiàn),與DN組相比,GG_M組的NAG活力顯著降低(p0.01),CRE和BUN含量極顯著降低(p0.001,p0.001)。說明葛根提取物對DN的保護作用與給藥劑量呈U型關(guān)系,且中劑量給藥組的保護效果最佳。(3)組織形態(tài)學分析通過HE、PAS和Masson染色法觀察小鼠腎臟病理改變,發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎小球系膜增生,間質(zhì)炎癥細胞浸潤,并伴有間質(zhì)水腫現(xiàn)象。GG_M組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本完整,上述病變減弱,組織結(jié)構(gòu)趨近正常小鼠。腎臟透射電鏡結(jié)果顯示,DN小鼠基底膜增厚,足突腫脹肥大,畸形線粒體增多,GG_M組小鼠細胞結(jié)構(gòu)整齊,上述病變減弱。胰臟透射電鏡結(jié)果顯示,DN小鼠β細胞呈不規(guī)則肥大,出現(xiàn)兩兩融合,線粒體畸形改變,GG_M組小鼠細胞上述病變減弱。表明葛根提取物可以緩解DN小鼠腎臟和胰臟病變,對DN小鼠起到保護作用。2.基于代謝組學分析葛根提取物對糖尿病腎病的保護作用采用UPLC-Q-TOF和GC-MS技術(shù)對各組小鼠血清樣品分析發(fā)現(xiàn),空白組、DN模型組和保護組的組內(nèi)聚集度良好、組間分離度較大。篩選出脂質(zhì)類如:LysoPI(20:0/0:0),膽汁酸類如:Taurohyocholate等多種不同類別的差異性生物標記物。并分析得出甘油磷脂代謝、線粒體中脂肪酸延長等代謝通路發(fā)生變化。提示線粒體功能障礙導致能量代謝異常,可能是DN發(fā)病的關(guān)鍵因素。3.基于AMPK/SIRT1/PGC1α和PINK/PARKIN通路研究葛根提取物對DN小鼠的保護作用a.AMPK/SIRT1/PGC1α通路與空白組相比,DN小鼠的AMPK蛋白表達量極顯著上調(diào)(p0.001);SIRT1蛋白表達量下調(diào)(p0.01);PGC-1α蛋白表達量極顯著下調(diào)(p0.001)。與DN模型組相比,保護組AMPK蛋白表達量極顯著下調(diào)(p0.001);SIRT1和PGC-1α蛋白表達量極顯著上調(diào)(p0.001,p0.001)。說明DN小鼠的AMPK/SIRT1/PGC1α通路受到抑制,葛根提取物可以激活AMPK,促進SIRT1表達,提升PGC-1α去乙酰反應,促進線粒體生物發(fā)生。b.PINK1/PARKIN通路與空白組相比,DN組PINK1蛋白水平顯著下調(diào)(p0.01);PARKIN蛋白表達量上調(diào)(p0.05)。與DN組相比,保護組的PINK1蛋白表達量顯著上調(diào)(p0.01);PARKIN蛋白表達量顯著下調(diào)(p0.01)。說明DN小鼠的PINK1/PARKIN通路受到抑制,葛根提取物可以刺激PINK1蛋白的表達,激活PARKIN蛋白對受損線粒體的泛素化過程,促進線粒體自噬的進行。提示DN的發(fā)生與線粒體生物發(fā)生、線粒體自噬這一動態(tài)平衡被打破有關(guān),葛根提取物對DN小鼠的保護作用也可以通過恢復這一動態(tài)平衡來實現(xiàn)。
【學位授予單位】：陜西科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

陜西科技大學碩士學位論文2.4 實驗結(jié)果通過對不同組別小鼠體重、飲食等生理變化分析可以初步得出小鼠的精神狀態(tài)，推測出小鼠的健康狀況。對血液中脂類代謝物分析，可以評價小鼠的代謝機制是否處于正常狀態(tài)。對血液中腎功能評價指標分析，可以了解小鼠腎臟組織的健康狀況以及疾病的發(fā)生程度。所以，將實驗結(jié)果從下面幾個方面展示：2.4.1 鎘致糖尿病腎病損傷模型的驗證對 Con 組、HF 組、Cd 組和 HF+Cd 組小鼠的各項試驗結(jié)果分析如下：a. 不同損傷形式對小鼠生理、生化指標的影響

葛根提取物對鎘致糖尿病腎病小鼠保護作用的研究食量和進食量升高，空腹血糖值升高 60%（如圖 2-1D）。結(jié)果表明，單獨的鎘處理和單獨的高脂高糖飲食處理時，都會影響小鼠的正常生活狀況，但短時間內(nèi)不會形成疾病反應。當鎘和高脂高糖飲食共同處理時，小鼠表現(xiàn)出精神狀態(tài)萎靡，毛色暗淡且伴有油漬，追逐、攀爬等活動量減少以及“三多一少”癥狀。b. 不同形式損傷對小鼠糖、脂代謝的影響由圖 2-2A 可以發(fā)現(xiàn)，與 Con 組的正常小鼠相比，HF 組血清中的 TC 水平顯著升高2 倍（p<0.01）；Cd 組小鼠的 TC 水平升高 20%（p<0.05）。HF+Cd 組血清中的 TC 含量升高 1 倍（p<0.05），介于 HF 組合 Cd 組之間。可見高脂高糖飲食易造成血液中 TC 含量升高，但氯化鎘和高脂高糖飲食共同誘導時，臟器損傷加重，紊亂的代謝機制會導致TC 含量波動較大。

陜西科技大學碩士學位論文20%（p<0.05）。提示氯化鎘聯(lián)合高脂高糖誘導可能會導致小鼠糖脂代謝紊亂，已具備DN 的基本特征。由圖 2-2C 中可以看出，與 Con 組相比，HF 組 HDL 含量顯著升高 26%（p<0.01），Cd 組 HDL 含量極顯著降低 40%，HF+Cd 組的 HDL 含量極顯著降低 70%（p<0.001）。說明氯化鎘和高脂高糖飼料聯(lián)合誘導時對小鼠的損傷程度最大。由圖 2-2D 可以看出，與 Con 組相比，HF 組小鼠 LDL 含量升高 30%（p<0.05）；Cd組小鼠的 LDL 含量顯著升高 1 倍有余（p<0.01）；HF+Cd 組小鼠 LDL 的升高量達到 4倍之多（p<0.001）。說明氯化鎘聯(lián)合高脂高糖飼料誘導的效果是單純高脂高糖飼料和氯化鎘誘導的總和。c. 不同形式損傷對小鼠腎功能的影響

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本文編號：2743050