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《西北大學(xué)》 2004年

HIV-1 Gag蛋白的重組、表達(dá)與應(yīng)用

衛(wèi)陽  

【摘要】：獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunoceficiency syndrome，AIDS)是當(dāng)今世界影響最大，危害也最大的疾病之一，它的防治迫在眉睫。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是AIDS的病原體，其中編碼核心蛋白的gag基因是HIV基因中最保守的一段。含有p24和p17的核心蛋白，又稱Gag蛋白具有一定的抗原性，而且抗Gag蛋白的抗體是HIV感染后可從血液中最早檢出的抗體，，因此HIV-Gag蛋白對(duì)AIDS的檢測有著重要的作用。 本文主要是對(duì)HIV-gag基因的重組、表達(dá)和應(yīng)用進(jìn)行了研究。目的 研制HIV抗體診斷試劑。方法 根據(jù)從Genbank上查詢到的HIV-gag基因的序列，分別設(shè)計(jì)了上游引物(gagF)：5’-CGGATCCA ATG GGT GCG AGA GCG TCA-3’和下游引物(gagR)：5’-CGGAATTCGT GTC GTT GCC AAA GAG TGA-3’。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法從HIV-1的基因中擴(kuò)增出gag的DNA。經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后，用T4 DNA連接酶將gag的DNA插入表達(dá)載體pTrcHis2 A質(zhì)粒中，構(gòu)成重組的gag-pTrcHis2 A質(zhì)粒。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21(DE3)中，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的蛋白用Ni~(2+)親和層析柱純化后做SDS-PAGE檢測，以及蛋白印跡(Western blot，Wb)和間接ELISA實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用研究。結(jié)果 SDS-PAGE電泳顯示，表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為41kD，與預(yù)計(jì)的值相同；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，陽性血清和陰性血清的檢出符合率分別為100％(10／10)和100％(40／40)；ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，10ng重組的Gag抗原與稀釋了100倍的血清反應(yīng)，陽性血清和陰性血清的檢出符合率分別為100％(10／10)和100％(80／80)。結(jié)論 所研制的重組Gag蛋白正確表達(dá)，而且具有較高的抗原特異性和敏感性，可用于制備HIV抗體診斷試劑。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R512.91
【目錄】：

摘要7-8

ABSTRACT8-9

第一部分 前言9-19

1 艾滋病及其流行狀況簡介9-10

2 HIV簡介10-13

2.1 HIV的結(jié)構(gòu)10-12

2.1.1 基因組11

2.1.2 病毒蛋白11-12

2.2 HIV的生活周期12

2.3 HIV的主要生物及物理特性12-13

3 Gag抗原的抗HIV的保護(hù)功能13

4 HIV的檢測13-17

4.1 HIV檢測中的重要抗原及Gag抗原抗體的特性13-14

4.2 常用的HIV的實(shí)驗(yàn)方法14

4.3 標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)14-17

4.4 p24抗原檢測HIV感染17

5 國內(nèi)外的HIV檢測研究狀況17-18

6 論文研究內(nèi)容18-19

第二部分 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容19-36

1 材料與儀器19-21

1.1 質(zhì)粒與菌種19-20

1.2 主要試劑及材料20

1.3 主要儀器20-21

2 方法21-27

2.1 目的基因的克隆與鑒定21-22

2.1.1 目的基因片斷的PCR擴(kuò)增21-22

2.1.2 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化22

2.1.3 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定22

2.2 重組載體的構(gòu)建與鑒定22-24

2.2.1 雙酶切載體質(zhì)粒22

2.2.2 雙酶切目的DNA22

2.2.3 連接目的DNA和質(zhì)粒22-23

2.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Top 10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增23

2.2.5 重組質(zhì)�？焖贆z測23

2.2.6 制備重組質(zhì)粒并鑒定23-24

2.2.7 重組質(zhì)粒的電泳鑒定24

2.2.8 重組質(zhì)粒的雙酶切電泳鑒定24

2.3 表達(dá)菌株的篩選24-25

2.3.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞24

2.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)24

2.3.3 SDS-PAGE電泳檢測24-25

2.4 表達(dá)的Gag蛋白Ni-NTA分離純化25-26

2.4.1 表達(dá)細(xì)胞的裂解物的制備25

2.4.2 Ni-NTA柱的準(zhǔn)備25

2.4.3 變性條件下純化25-26

2.5 透析濃縮及復(fù)性26

2.6 測蛋白含量26

2.7 表達(dá)蛋白作蛋白印跡(Western Blotting)檢測26-27

2.8 抗原的間接酶聯(lián)免疫應(yīng)用27

3 結(jié)果27-34

3.1 大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)重組質(zhì)粒gag-pTrcHis2 A的構(gòu)建策略27-28

3.2 gag基因的PCR克隆與鑒定28

3.3 重組載體的構(gòu)建與鑒定28-29

3.4 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定29-30

3.5 重組蛋白的純化30-31

3.6 透析濃縮及復(fù)性后蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算31-32

3.7 Western blot32-33

3.8 ELISA的應(yīng)用研究33-34

4 討論34-36

第三部分 小結(jié)36-37

參考文獻(xiàn)37-42

致謝42

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【參考文獻(xiàn)】

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