發(fā)布時(shí)間：2018-07-05 21:06

  本文選題：1.谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1 + 周期素依賴(lài)性蛋白激酶5��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： 苯丙胺類(lèi)藥物(Amphetamine, AMPH)是一類(lèi)成癮性藥物,使用這類(lèi)藥物可以讓人產(chǎn)生欣感、厭食以及各種幻想。AMPH類(lèi)藥物的核心結(jié)構(gòu)都是p苯乙胺,這類(lèi)藥物都有容易通過(guò)血腦屏障,抵御生物轉(zhuǎn)化以及刺激神經(jīng)末梢釋放單胺類(lèi)遞質(zhì)的特點(diǎn)。MPH類(lèi)藥物還可以通過(guò)抑制單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)對(duì)胺類(lèi)物質(zhì)的氧化。甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),俗稱(chēng)“冰毒,是新型合成類(lèi)毒品,屬于苯丙胺類(lèi)神經(jīng)興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant, ATS),具有見(jiàn)效快、興奮作用維持時(shí)間長(zhǎng),價(jià)格低廉,化學(xué)合成技術(shù)簡(jiǎn)單,多途徑攝取等特點(diǎn),成為全球第二個(gè)使用最廣泛的非法藥物類(lèi)別。吸服冰毒后容易造成一系列不良癥狀,例如心血管疾病、精神病、神經(jīng)精神癥狀、脫水、橫紋肌溶解以及肝腎衰竭,這些不但給吸毒個(gè)人帶來(lái)痛苦的體驗(yàn),更給家庭以及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。 METH最大的特點(diǎn)是一旦使用便會(huì)上癮。它的另一特點(diǎn),是在成癮的同時(shí)會(huì)對(duì)人體重要器官造成器質(zhì)性損害,特別是對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷作用與其他毒品相比,異常突出。METH可導(dǎo)致人大腦黑質(zhì)、紋狀體、海馬、皮質(zhì)等多部位損傷,星狀細(xì)胞病變、腦腫脹和變性、蒼白球的退行性變化、脊髓灰質(zhì)的壞死等。研究報(bào)道,METH濫用者有腦結(jié)構(gòu)異常,表現(xiàn)為紋狀體體積增大,海馬體積減少,白質(zhì)體積增大,大腦皮質(zhì)體積減小,選擇性的內(nèi)側(cè)顳葉和扣帶-邊緣區(qū)域損害等。這些部位與大腦代謝失調(diào)、記憶障礙等相關(guān)、認(rèn)知障礙、警覺(jué)功能障礙有關(guān)。臨床上METH濫用者出現(xiàn)記憶力下降、幻聽(tīng)、被害妄想、易激惹、性暴力、自殺、他殺等精神和暴力行為,與上述改變密切相關(guān)。已證實(shí),METH濫用所引起的刑事犯罪更為突出,不同的是海洛因成癮者的犯罪多為籌措毒資,而METH濫用的刑事犯罪主要是在毒性作用下的直接暴力行為所致。這提示METH濫用所致的毒性損傷作用強(qiáng),對(duì)社會(huì)治安的危害性更大。 關(guān)于METH是如何導(dǎo)致上述損傷,其機(jī)制仍不明確,現(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示多種機(jī)制參與了METH的神經(jīng)毒性,主要包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等,其中氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要機(jī)制作用之一。其中這些機(jī)制并不是獨(dú)立存在,既有相互交叉,又分別發(fā)揮著不同的作用。我們對(duì)METH導(dǎo)致的神經(jīng)損傷大體分為兩類(lèi),一類(lèi)是導(dǎo)致氧自由基、氮自由基等活性物質(zhì)的清除能力減弱和導(dǎo)致的神經(jīng)損傷,屬于防護(hù)能力不足。另一類(lèi)是損傷相關(guān)通路的層層激活以及細(xì)胞器的受損又推動(dòng)神經(jīng)損傷的進(jìn)一步加劇,包括一些凋亡通路的正性激活。 過(guò)去我們的研究發(fā)現(xiàn)METH使用使得多個(gè)腦區(qū)激活nNOS/NO,促進(jìn)生成大量的硝基化蛋白。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1(Glutathione S-transferase Pi, GSTP1)在毒理學(xué)上有一定的重要性,它可以催化親核性的谷胱甘肽與各種親電子外源化學(xué)物的結(jié)合反應(yīng)。許多外源化學(xué)物在生物轉(zhuǎn)化第一相反應(yīng)中極易形成某些生物活性中間產(chǎn)物,它們可與細(xì)胞生物大分子重要成分發(fā)生共價(jià)結(jié)合,對(duì)機(jī)體造成損害。谷胱甘肽與其結(jié)合后,可防止發(fā)生此種共價(jià)結(jié)合,起到解毒作用。而GSTP1的硝基化可能會(huì)導(dǎo)致到對(duì)催化GSH結(jié)合親電子外源化學(xué)物的能力減弱從而導(dǎo)致GSH抵抗氧化應(yīng)激的能力減弱。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GSTP1是調(diào)節(jié)CDK5的新基因,GSTP1可通過(guò)直接解除P25/P35的結(jié)合去抑制CDK5的活性,還可以間接消除氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷,減少CDK5激活所帶來(lái)的神經(jīng)退行性變以及神經(jīng)細(xì)胞的死亡[13]。 METH的神經(jīng)毒性還表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞骨架的損傷,這成為了成癮以及運(yùn)動(dòng)功能異常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。我們前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Rho相關(guān)激酶2(Rho-associated coiled coil forming protein kinase Ⅱ, ROCK2)在METH處理后表達(dá)增加活性增強(qiáng)。過(guò)去的研究中認(rèn)為ROCK2參與了生長(zhǎng)錐的坍塌以及神經(jīng)元的的回縮。ROCK的抑制可以保護(hù)缺血導(dǎo)致的腦部損傷,防止神經(jīng)元的壞死與凋亡。于是本課題第二部分實(shí)驗(yàn)提出了抑制ROCK2可能對(duì)METH損傷的神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用是第二章要解決的內(nèi)容。抑制ROCK2對(duì)細(xì)胞骨架以及神經(jīng)元的損傷是否有保護(hù)作用；ROCK2在METH導(dǎo)致的神經(jīng)毒性中扮演的角色以及相關(guān)機(jī)制是本論文重點(diǎn)討論的問(wèn)題。上述兩部分的研究目的在于探尋METH導(dǎo)致神經(jīng)毒性的機(jī)理以及尋找合理的干預(yù)手段。 方法： 第一章第一節(jié)建立7-NI抑制nNOS/NO的METH中毒體內(nèi)模型,通過(guò)western blot以及免疫組化觀察GSTP1在METH以及抑制1iNOS/NO抑制后的表達(dá)情況以及3-NT/GSTP1的比例。第一章第二節(jié)構(gòu)建GSTP1過(guò)表達(dá)慢病毒,通過(guò)免疫熒光以及MTT選擇合適的病毒感染滴度,通過(guò)Western blot驗(yàn)證LV-3flag-eGFP-GSTP1在PC12以及原代黑質(zhì)神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)染效率；通過(guò)Annexin V-PE/PI雙染以及Hoechst染色檢測(cè)過(guò)表達(dá)GSTP1的PC12細(xì)胞以及原代黑質(zhì)神經(jīng)元與野生型PC12細(xì)胞以及原代黑質(zhì)神經(jīng)元在METH處理后凋亡率的改變。Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)GSTP1對(duì)CDK5在METH處理后表達(dá)量的影響。通過(guò)化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)GSTP1過(guò)表達(dá)對(duì)METH導(dǎo)致ROS產(chǎn)生量的影響。第一章第三節(jié)通過(guò)在雙側(cè)SN區(qū)立體定位注射GSTP1重組慢病毒,通過(guò)熒光顯微鏡以及Western blot觀察其在SN區(qū)以及各投射的腦區(qū)的表達(dá)情況。第二章第一節(jié)通過(guò)QPCR以及Western觀察ROCK2在PC12細(xì)胞中的增高是否具有METH濃度依賴(lài)性。構(gòu)建ROCK2特異性小RNA干擾siROCK2,通過(guò)western blot、QPCR以及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)siROCK2在PC12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率以及干擾率。通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡技術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染以及TUNEL染色檢測(cè)干擾ROCK2對(duì)METH導(dǎo)致PC12細(xì)胞的凋亡作用。通過(guò)化學(xué)檢測(cè)檢法檢測(cè)ROCK2抑制對(duì)METH導(dǎo)致ROS產(chǎn)生量的影響。通過(guò)QPCR檢測(cè)RhoA在METH處理PC12中轉(zhuǎn)錄水平的改變,以及干擾ROCK2是否對(duì)RhoA的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響。通過(guò)Western blot檢測(cè)干擾ROCK2對(duì)METH相關(guān)的Akt磷酸化、caspase-3活化以及PARP分裂的作用,探尋抑制ROCK2逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。通過(guò)免疫熒光染色觀察ROCK2干擾對(duì)METH導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架、樹(shù)突棘密度以及樹(shù)突長(zhǎng)度以及樹(shù)突分叉的改變。通過(guò)western blot檢測(cè)干擾ROCK2是否對(duì)METH處理原代黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的MLC的磷酸起作用,探尋抑制ROCK2正性調(diào)節(jié)METH導(dǎo)致細(xì)胞骨架異常的機(jī)制。第二章第二節(jié)通過(guò)western blot以及免疫熒光觀察METH處理后PFc、Str、Hip以及SN中ROCK2表達(dá)的改變。使用ROCK2藥物阻斷劑Fasudil建立ROCK2干擾的METH體內(nèi)亞急性動(dòng)物模型,通過(guò)Open field觀察Fasudil對(duì)METH毒性損傷相關(guān)自主運(yùn)動(dòng)功能是否有逆轉(zhuǎn)功能。通過(guò)western blot檢測(cè)Fasudil對(duì)METH處理后大鼠腦組織中ROCK2降低的量。通過(guò)TUNEL以及尼氏染色觀察METH亞急性中毒模型中神經(jīng)元的損傷,TH染色觀察METH處理后在Str以及SN兩個(gè)腦區(qū)中TH-ir神經(jīng)末梢以及胞體的改變,判斷Fasudil對(duì)METH損傷的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用.通過(guò)免疫組化集合比較Fasudil是否對(duì)METH損傷相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記Grp78、線粒體損傷標(biāo)記Bax、凋亡下游caspase-3激活態(tài)、DAT、以及促進(jìn)氧化應(yīng)激因子CDK5在SN區(qū)的表達(dá)有影響,探尋抑制ROCK2對(duì)METH神經(jīng)性逆轉(zhuǎn)的可能機(jī)制。 結(jié)果： 第一章第一節(jié)圖1-1-1顯示nNOD/NO抑制的METH亞急性模型構(gòu)建成功。圖1-1-2A免疫組化顯示METH組與空白處理組相比GSTP1在Str以及SN區(qū)的表達(dá)降低。圖1-1-2B Western blot顯示在Str區(qū)中,7-NI+METH組中3-NT/GSTP1比值比METH組降低58.24%(*p0.01,n=3);7-NI+METH組GSTP1蛋白含量比METH組增加158.0%(#p0.001,n=3),圖1-1-2C Western blot顯示在SN區(qū)中,7-NI+METH組中3-NT/GSTP1比值比METH組降低44.3%(*p0.05,n=3)；7-NI+METH組GSTP1蛋白含量比METH組增加了161.0%(#p0.001,n=3)。 第一章第二節(jié)圖1-2-1至圖1-2-6顯示成功構(gòu)建GSTP1重組慢病毒。圖1-2-7原代黑質(zhì)神經(jīng)元的鑒定結(jié)果為T(mén)H-ir神經(jīng)元占該原代培養(yǎng)神經(jīng)元的31±3%。圖1-2-8顯示LV-3flag-eGFP-GSTP1轉(zhuǎn)染原代黑質(zhì)神經(jīng)元的最佳滴度為5×106TU/ml,圖1-2-9顯示LV-3flag-eGFP-GSTP1轉(zhuǎn)染PC12中最佳轉(zhuǎn)染滴度為1×107TU/ml。圖1-2-10流式檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡顯示在最佳LV-3flag-eGFP-GSTP1轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的滴度下,METH處理的情況下,ExpGSTP1組比saline組凋亡率降低66.5%,*p0.001,n=3。圖1-2-11Hoechst標(biāo)記凋亡顯示,在METH處理下,ExpGSTP1比METH組原代黑質(zhì)神經(jīng)元Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低50.03%(p0.001,n=3),認(rèn)為GSTP1的過(guò)表達(dá)可部分降低METH導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元的hoechst陽(yáng)性率。圖1-2-12A PCR結(jié)果顯示2.0mM METH處理PC12細(xì)胞24h后,METH組中CDK5mRNA水平與Con組相比升高了157.0%,*p0.001,n=3,結(jié)果說(shuō)明METH處理增加CDK5的mRNA水平。圖1-2-12B Western blot結(jié)果顯示GSTP1過(guò)表達(dá)可部分降低METH導(dǎo)致增高的CDK5。圖1-2-13顯示GSTP1過(guò)表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致增多的ROS。在PC12細(xì)胞中METH+ExpGSTP1組與單加METH組相比可使ROS減少5.73%,F=40.83,*p0.05。在原代黑質(zhì)神經(jīng)元中METH+ExpGSTP1組與單加METH組相比可使ROS減少6.9%,F=97.88,**p0.01。 第一章第三節(jié)圖1-3-1結(jié)果顯示,5uL LV-3flag-eGFP-GSTP1進(jìn)行SN區(qū)立體定位注射8周后,發(fā)現(xiàn)SN區(qū)以及SN大部分的投射區(qū)都帶有綠色熒光蛋白,圖1-3-2Western blot結(jié)果顯示PFc、Str、Hip以及SN區(qū)出現(xiàn)GSTP1的過(guò)表達(dá)。 第二章第一節(jié)圖2-1-1A顯示METH處理可導(dǎo)致ROCK2的mRNA水平升高,在METH為2.0mM和2.5mM的濃度時(shí),ROCK2mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照組的4.78和4.99倍,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=5.05,*P0.05,n=3)。圖2-1-1B、C顯示METH處理可導(dǎo)致ROCK2蛋白水平的增加。2.0mM METH處理PC1224h后熒光顯微鏡鏡下觀察,METH處理的PC12細(xì)胞的突起變短,綠色熒光(ROCK2標(biāo)記)的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。Western blot顯示隨METH濃度增加160kD位置上的密度增加。圖2-1-2A、B、B1顯示Lipo作為載體對(duì)siROCK2轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的影響,Lipo/siROCK2組的轉(zhuǎn)染效率為69.86%,而siROCK2組的效率和對(duì)照組的效率分別為0.66%和0.59%。圖2-1-2C顯示siROCK2最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為48h,圖2-1-2D顯示siROCK2最佳轉(zhuǎn)染濃度為100nM的siROCK2, Lipo/siROCK2能夠顯著沉默ROCK2表達(dá)。圖2-1-2E siNC干擾對(duì)ROCK2的表達(dá)沒(méi)有影響。圖2-1-3A、A'顯示Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示Lipo/siROCK2預(yù)處理的凋亡率與METH組相比減少了52.38%,p0.001,n=3。Lipo/siROCK2組相比Lipo2000或Lipo/siNC處理組相比,可明顯的減少PC12細(xì)胞的凋亡(F=876.56,*P0.001,n=3,)。這些結(jié)果表明,抑制ROCK2表達(dá)可減少M(fèi)ETH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。圖2-1-3B、B’顯示TUNEL染色檢測(cè)凋亡,2.0mM METH處理的PC12細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的8.9倍,*P0.01。Lipo/siROCK2預(yù)處理2.0mM METH組與2.0mM METH單獨(dú)處理組相比,TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量減少60.2%,P0.01,接受100nM的siNC預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量卻沒(méi)有明顯變化。Lipo/siROCK2預(yù)處理組缺乏用箭頭所示的典型的凋亡環(huán)形核結(jié)構(gòu)。圖2-1-4顯示,METH+siROCK2組ROS比率與METH組以及METH+siNC組比分別降低了5.3%以及5.1%(*p0.05,n=3),認(rèn)為ROCK2抑制可以有效降低METH導(dǎo)致PC12細(xì)胞中ROS增加。圖2-1-5A顯示RhoA的mRNA水平隨METH的濃度增加而增加,具有濃度依賴(lài)性。2mM的METH處理組RhoA的mRNA比Con組增加了71.84%,**p0.05,n=3。圖2-1-5B顯示,尚不能認(rèn)為siROCK2的使用與METH使用的交互效應(yīng)對(duì)RhoA的mRNA水平的升高有影響(F=42.32,*p0.05,n=3)。認(rèn)為METH處理的PC12細(xì)胞中,ROCK2的激活可能與RhoA轉(zhuǎn)錄水平增加有關(guān)。圖2-1-5C1Western blot結(jié)果顯示抑制ROCK2與其逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制相關(guān)。圖2-1-5C2顯示,METH+siROCK2組p-Akt/Akt比率與METH+Lipo組相比增加了51.0%,p0.001,n=3。認(rèn)為ROCK2的抑制可增加METH導(dǎo)致PC12細(xì)胞中降低的p-Akt/Akt比率。METH+Lipo組p-Akt/Akt比率與Con組相比降低42.0%,*p0.01,n=3。認(rèn)為抑制ROCK2可提高M(jìn)ETH處理的PC12細(xì)胞中p-Akt/Akt比率。從而促進(jìn)PC12細(xì)胞的存活。圖2-1-5C3顯示METH+Lipo組cleave PARP/PARP比率與Con組增加了131%,**p0.001,n=3,認(rèn)為METH使用導(dǎo)致PC12細(xì)胞中PARP的分裂增力。METH+siROCK2組cleave PARP/PARP比率與METH+Lipo組比無(wú)統(tǒng)計(jì)意義,#p0.05,n=3。尚不認(rèn)為siROCK2可減少M(fèi)ETH導(dǎo)致增加的cleave PARP/PARP比率。圖2-1-5C4顯示METH+Lipo組ctive-capspase3與Con組相比增加了200%,**p0.001,n=3,認(rèn)為METH使用導(dǎo)致PC12細(xì)胞中active-capspase3的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。METH+siROCK2組active-capspase3與METH+Lipo組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,#p0.05,n=3,尚不認(rèn)為抑制ROCK2是通過(guò)降低caspase3激活這一途徑保護(hù)神經(jīng)元。以上說(shuō)明ROCK2抑制對(duì)METH導(dǎo)致PC12細(xì)胞的凋亡可能通過(guò)通過(guò)提高p-Akt/Akt比例,而不是通過(guò)抑制METH導(dǎo)致caspase3的激活以及PARP的分裂途徑。圖2-1-6顯示METH處理導(dǎo)致樹(shù)突解體和突起長(zhǎng)度的縮短。然而,PC12形態(tài)的變化在METH+Lipo/siROCK2組中得到恢復(fù)。圖2-1-7顯示.抑制ROCK2可部分恢復(fù)METH導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突分叉數(shù)目的減少以及神經(jīng)突長(zhǎng)度的縮短。圖2-1-8顯示干擾ROCK2可部分恢復(fù)METH導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突棘的密度的降低。圖2-1-9A顯示干擾ROCK2可部分逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元的輪廓坍塌。圖2-1-9B1、B2METH+Saline組的p-MLC/MLC比率與Con/Saline組相比增加54.0%,**p0.001,n=3,認(rèn)為METH所導(dǎo)致原代黑質(zhì)神經(jīng)元中p-MLC/MLC比率增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明干擾ROCK2可降低METH所導(dǎo)致增加的p-MLC/MLC比率,從而增加F-actin的穩(wěn)定性,有利于增加細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,維持細(xì)胞輪廓。 第二章第二節(jié)圖2-2-1免疫熒光以及western blot顯示在體模型上ROCK2在METH處理后Str、SN以及PFc區(qū)增加明顯,而Hip增加不明顯。圖2-2-2open field檢測(cè)大鼠自主運(yùn)動(dòng)行為結(jié)果顯示,分組與觀察時(shí)間的交互效應(yīng)不顯著F=0.16,#P0.05,認(rèn)為分組間的差別不隨觀察時(shí)間的不同而改變。采用調(diào)整的基于估計(jì)邊緣值的LSD法進(jìn)行不同分組間指標(biāo)的多重指標(biāo)值的多重比較,Con組、Fasudil組、METH組以及Fasudil組間均無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05。METH停藥后48h與對(duì)照組相比,大鼠自主活動(dòng)的在各組以及各時(shí)間段變化并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并未體現(xiàn)出Fasudil對(duì)METH損害的大鼠自主行為有保護(hù)作用。圖2-2-3Western blot顯示Fasudil可部分抑制METH導(dǎo)致Str以及SN區(qū)中ROCK2的增加,說(shuō)明抑制ROCK2的METH模型構(gòu)建成功。圖2-2-4中TUNEL染色顯示末次METH使用后48h, METH組與Con組比并未在PFc、Str、Hip以及SN區(qū)發(fā)現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的增加,不認(rèn)為此種建模方式導(dǎo)致大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。圖2-2-5中尼氏染色顯示末次METH使用后48h,MEETH組與Con組比PFc、Str、Hip以及SN區(qū)發(fā)現(xiàn)尼氏染色陽(yáng)性的細(xì)胞減少,認(rèn)為此種建模方式導(dǎo)致大鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷。圖2-2-6TH染色顯示末次METH使用后48h, Str區(qū)TH-ir的面積大量減少,Fasudil的使用可以逆轉(zhuǎn)這一改變；SN區(qū)TH-ir的神經(jīng)元數(shù)目大量減少,Fasudil的使用可以逆轉(zhuǎn)這一改變。圖2-2-7免疫組化結(jié)果顯示METH可以降低DAT表達(dá)以及升高Grp78、Bax、CDK5的表達(dá),而對(duì)激活的caspase3改變不明顯。Fasudil聯(lián)合METH使用可部分恢復(fù)METH對(duì)DAT、Bax、Grp78及CDK5四個(gè)指標(biāo)的改變。提示抑制ROCK2可能通過(guò)抑制線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激對(duì)METH損傷上神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行保護(hù)。 結(jié)論： 第一章 1.體內(nèi)模型中證實(shí)GSTP1表達(dá)在METH處理后表達(dá)降低。 2.GSTP1不在METH處理后的表達(dá)降低是由部分由iNOS介導(dǎo)。 3.GSTP1對(duì)METH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有抑制作用。 4.CDK5可能為GSTP1在METH神經(jīng)毒性作用機(jī)制的下游因子。 5.成功構(gòu)建SN及SN投射區(qū)區(qū)GSTP1過(guò)表達(dá)的大鼠模型。 第二章 1.ROCK2表達(dá)的增高具有METH濃度依賴(lài)性。 2.成功合成高效能的siROCK2,并能成功敲低PC12細(xì)胞以及原代中腦神經(jīng)元中ROCK2的表達(dá)。 3.抑制ROCK2能部分逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致PC12細(xì)胞的凋亡。 4.抑制ROCK2能部分降低METH所導(dǎo)致氧化應(yīng)激。 5.抑制ROCK2通過(guò)增加Akt磷酸比例減輕METH導(dǎo)致的凋亡,而并非通過(guò)抑制caspase3的激活及PARP的分裂。 6.抑制ROCK2能逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致的PC12細(xì)胞形態(tài)異常以及原代黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架的不穩(wěn)定性,維持樹(shù)突的分支以及長(zhǎng)度。其機(jī)制可能是通過(guò)提高降低p-MLC/MLC去實(shí)現(xiàn)的。 7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)METH處理后ROCK2能在PFc、SN、Str區(qū)明顯增加,而在Hip區(qū)增加不明顯。 8.在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制ROCK2可保護(hù)METH損傷的TH-ir陽(yáng)性神經(jīng)末梢以及胞體。 9.尼氏體的損傷以及TH染色可能比TUNEL染色檢測(cè)凋亡更敏感地反應(yīng)METH導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。 10.在體實(shí)驗(yàn)提示抑制ROCK2可能通過(guò)維持多巴胺的轉(zhuǎn)運(yùn)水平、抑制線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及氧化應(yīng)激的途徑發(fā)揮的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 李成敏;顏慧;高文靜;劉麗宏;宮澤輝;;頭孢曲松對(duì)甲基苯丙胺致大鼠行為及紋狀體氨基酸等遞質(zhì)含量改變的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2011年02期

2 劉志民,呂憲祥;我國(guó)藥物濫用監(jiān)測(cè)概述[J];中國(guó)藥物依賴(lài)性雜志;2004年01期

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本文編號(hào)：2101792