發(fā)布時間：2018-07-05 21:06

  本文選題：1.谷胱甘肽S轉移酶1 + 周期素依賴性蛋白激酶5　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： 苯丙胺類藥物(Amphetamine, AMPH)是一類成癮性藥物,使用這類藥物可以讓人產生欣感、厭食以及各種幻想。AMPH類藥物的核心結構都是p苯乙胺,這類藥物都有容易通過血腦屏障,抵御生物轉化以及刺激神經末梢釋放單胺類遞質的特點。MPH類藥物還可以通過抑制單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)對胺類物質的氧化。甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),俗稱“冰毒,是新型合成類毒品,屬于苯丙胺類神經興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant, ATS),具有見效快、興奮作用維持時間長,價格低廉,化學合成技術簡單,多途徑攝取等特點,成為全球第二個使用最廣泛的非法藥物類別。吸服冰毒后容易造成一系列不良癥狀,例如心血管疾病、精神病、神經精神癥狀、脫水、橫紋肌溶解以及肝腎衰竭,這些不但給吸毒個人帶來痛苦的體驗,更給家庭以及社會帶來沉重的負擔。 METH最大的特點是一旦使用便會上癮。它的另一特點,是在成癮的同時會對人體重要器官造成器質性損害,特別是對中樞神經細胞的毒性損傷作用與其他毒品相比,異常突出。METH可導致人大腦黑質、紋狀體、海馬、皮質等多部位損傷,星狀細胞病變、腦腫脹和變性、蒼白球的退行性變化、脊髓灰質的壞死等。研究報道,METH濫用者有腦結構異常,表現(xiàn)為紋狀體體積增大,海馬體積減少,白質體積增大,大腦皮質體積減小,選擇性的內側顳葉和扣帶-邊緣區(qū)域損害等。這些部位與大腦代謝失調、記憶障礙等相關、認知障礙、警覺功能障礙有關。臨床上METH濫用者出現(xiàn)記憶力下降、幻聽、被害妄想、易激惹、性暴力、自殺、他殺等精神和暴力行為,與上述改變密切相關。已證實,METH濫用所引起的刑事犯罪更為突出,不同的是海洛因成癮者的犯罪多為籌措毒資,而METH濫用的刑事犯罪主要是在毒性作用下的直接暴力行為所致。這提示METH濫用所致的毒性損傷作用強,對社會治安的危害性更大。 關于METH是如何導致上述損傷,其機制仍不明確,現(xiàn)階段的研究結果顯示多種機制參與了METH的神經毒性,主要包括氧化應激、神經元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等,其中氧化應激是METH所致神經毒性損傷的重要機制作用之一。其中這些機制并不是獨立存在,既有相互交叉,又分別發(fā)揮著不同的作用。我們對METH導致的神經損傷大體分為兩類,一類是導致氧自由基、氮自由基等活性物質的清除能力減弱和導致的神經損傷,屬于防護能力不足。另一類是損傷相關通路的層層激活以及細胞器的受損又推動神經損傷的進一步加劇,包括一些凋亡通路的正性激活。 過去我們的研究發(fā)現(xiàn)METH使用使得多個腦區(qū)激活nNOS/NO,促進生成大量的硝基化蛋白。谷胱甘肽S-轉移酶1(Glutathione S-transferase Pi, GSTP1)在毒理學上有一定的重要性,它可以催化親核性的谷胱甘肽與各種親電子外源化學物的結合反應。許多外源化學物在生物轉化第一相反應中極易形成某些生物活性中間產物,它們可與細胞生物大分子重要成分發(fā)生共價結合,對機體造成損害。谷胱甘肽與其結合后,可防止發(fā)生此種共價結合,起到解毒作用。而GSTP1的硝基化可能會導致到對催化GSH結合親電子外源化學物的能力減弱從而導致GSH抵抗氧化應激的能力減弱。近年來發(fā)現(xiàn)GSTP1是調節(jié)CDK5的新基因,GSTP1可通過直接解除P25/P35的結合去抑制CDK5的活性,還可以間接消除氧化應激帶來的損傷,減少CDK5激活所帶來的神經退行性變以及神經細胞的死亡[13]。 METH的神經毒性還表現(xiàn)在對細胞骨架的損傷,這成為了成癮以及運動功能異常的結構基礎。我們前期體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)Rho相關激酶2(Rho-associated coiled coil forming protein kinase Ⅱ, ROCK2)在METH處理后表達增加活性增強。過去的研究中認為ROCK2參與了生長錐的坍塌以及神經元的的回縮。ROCK的抑制可以保護缺血導致的腦部損傷,防止神經元的壞死與凋亡。于是本課題第二部分實驗提出了抑制ROCK2可能對METH損傷的神經系統(tǒng)有保護作用是第二章要解決的內容。抑制ROCK2對細胞骨架以及神經元的損傷是否有保護作用；ROCK2在METH導致的神經毒性中扮演的角色以及相關機制是本論文重點討論的問題。上述兩部分的研究目的在于探尋METH導致神經毒性的機理以及尋找合理的干預手段。 方法： 第一章第一節(jié)建立7-NI抑制nNOS/NO的METH中毒體內模型,通過western blot以及免疫組化觀察GSTP1在METH以及抑制1iNOS/NO抑制后的表達情況以及3-NT/GSTP1的比例。第一章第二節(jié)構建GSTP1過表達慢病毒,通過免疫熒光以及MTT選擇合適的病毒感染滴度,通過Western blot驗證LV-3flag-eGFP-GSTP1在PC12以及原代黑質神經元中的轉染效率；通過Annexin V-PE/PI雙染以及Hoechst染色檢測過表達GSTP1的PC12細胞以及原代黑質神經元與野生型PC12細胞以及原代黑質神經元在METH處理后凋亡率的改變。Western blot驗證過表達GSTP1對CDK5在METH處理后表達量的影響。通過化學檢測法檢測GSTP1過表達對METH導致ROS產生量的影響。第一章第三節(jié)通過在雙側SN區(qū)立體定位注射GSTP1重組慢病毒,通過熒光顯微鏡以及Western blot觀察其在SN區(qū)以及各投射的腦區(qū)的表達情況。第二章第一節(jié)通過QPCR以及Western觀察ROCK2在PC12細胞中的增高是否具有METH濃度依賴性。構建ROCK2特異性小RNA干擾siROCK2,通過western blot、QPCR以及流式細胞技術檢測siROCK2在PC12細胞中的轉染率以及干擾率。通過流式細胞檢測凋亡技術Annexin V-FITC/PI雙染以及TUNEL染色檢測干擾ROCK2對METH導致PC12細胞的凋亡作用。通過化學檢測檢法檢測ROCK2抑制對METH導致ROS產生量的影響。通過QPCR檢測RhoA在METH處理PC12中轉錄水平的改變,以及干擾ROCK2是否對RhoA的轉錄水平產生影響。通過Western blot檢測干擾ROCK2對METH相關的Akt磷酸化、caspase-3活化以及PARP分裂的作用,探尋抑制ROCK2逆轉METH導致神經細胞凋亡的相關機制。通過免疫熒光染色觀察ROCK2干擾對METH導致原代黑質神經元細胞骨架、樹突棘密度以及樹突長度以及樹突分叉的改變。通過western blot檢測干擾ROCK2是否對METH處理原代黑質區(qū)神經元的MLC的磷酸起作用,探尋抑制ROCK2正性調節(jié)METH導致細胞骨架異常的機制。第二章第二節(jié)通過western blot以及免疫熒光觀察METH處理后PFc、Str、Hip以及SN中ROCK2表達的改變。使用ROCK2藥物阻斷劑Fasudil建立ROCK2干擾的METH體內亞急性動物模型,通過Open field觀察Fasudil對METH毒性損傷相關自主運動功能是否有逆轉功能。通過western blot檢測Fasudil對METH處理后大鼠腦組織中ROCK2降低的量。通過TUNEL以及尼氏染色觀察METH亞急性中毒模型中神經元的損傷,TH染色觀察METH處理后在Str以及SN兩個腦區(qū)中TH-ir神經末梢以及胞體的改變,判斷Fasudil對METH損傷的神經細胞有保護作用.通過免疫組化集合比較Fasudil是否對METH損傷相關內質網應激標記Grp78、線粒體損傷標記Bax、凋亡下游caspase-3激活態(tài)、DAT、以及促進氧化應激因子CDK5在SN區(qū)的表達有影響,探尋抑制ROCK2對METH神經性逆轉的可能機制。 結果： 第一章第一節(jié)圖1-1-1顯示nNOD/NO抑制的METH亞急性模型構建成功。圖1-1-2A免疫組化顯示METH組與空白處理組相比GSTP1在Str以及SN區(qū)的表達降低。圖1-1-2B Western blot顯示在Str區(qū)中,7-NI+METH組中3-NT/GSTP1比值比METH組降低58.24%(*p0.01,n=3);7-NI+METH組GSTP1蛋白含量比METH組增加158.0%(#p0.001,n=3),圖1-1-2C Western blot顯示在SN區(qū)中,7-NI+METH組中3-NT/GSTP1比值比METH組降低44.3%(*p0.05,n=3)；7-NI+METH組GSTP1蛋白含量比METH組增加了161.0%(#p0.001,n=3)。 第一章第二節(jié)圖1-2-1至圖1-2-6顯示成功構建GSTP1重組慢病毒。圖1-2-7原代黑質神經元的鑒定結果為TH-ir神經元占該原代培養(yǎng)神經元的31±3%。圖1-2-8顯示LV-3flag-eGFP-GSTP1轉染原代黑質神經元的最佳滴度為5×106TU/ml,圖1-2-9顯示LV-3flag-eGFP-GSTP1轉染PC12中最佳轉染滴度為1×107TU/ml。圖1-2-10流式檢測PC12細胞凋亡顯示在最佳LV-3flag-eGFP-GSTP1轉染PC12細胞的滴度下,METH處理的情況下,ExpGSTP1組比saline組凋亡率降低66.5%,*p0.001,n=3。圖1-2-11Hoechst標記凋亡顯示,在METH處理下,ExpGSTP1比METH組原代黑質神經元Hoechst陽性細胞數降低50.03%(p0.001,n=3),認為GSTP1的過表達可部分降低METH導致原代黑質神經元的hoechst陽性率。圖1-2-12A PCR結果顯示2.0mM METH處理PC12細胞24h后,METH組中CDK5mRNA水平與Con組相比升高了157.0%,*p0.001,n=3,結果說明METH處理增加CDK5的mRNA水平。圖1-2-12B Western blot結果顯示GSTP1過表達可部分降低METH導致增高的CDK5。圖1-2-13顯示GSTP1過表達可部分逆轉METH導致增多的ROS。在PC12細胞中METH+ExpGSTP1組與單加METH組相比可使ROS減少5.73%,F=40.83,*p0.05。在原代黑質神經元中METH+ExpGSTP1組與單加METH組相比可使ROS減少6.9%,F=97.88,**p0.01。 第一章第三節(jié)圖1-3-1結果顯示,5uL LV-3flag-eGFP-GSTP1進行SN區(qū)立體定位注射8周后,發(fā)現(xiàn)SN區(qū)以及SN大部分的投射區(qū)都帶有綠色熒光蛋白,圖1-3-2Western blot結果顯示PFc、Str、Hip以及SN區(qū)出現(xiàn)GSTP1的過表達。 第二章第一節(jié)圖2-1-1A顯示METH處理可導致ROCK2的mRNA水平升高,在METH為2.0mM和2.5mM的濃度時,ROCK2mRNA的表達分別為對照組的4.78和4.99倍,具有顯著性統(tǒng)計學差異(F=5.05,*P0.05,n=3)。圖2-1-1B、C顯示METH處理可導致ROCK2蛋白水平的增加。2.0mM METH處理PC1224h后熒光顯微鏡鏡下觀察,METH處理的PC12細胞的突起變短,綠色熒光(ROCK2標記)的強度明顯增強。Western blot顯示隨METH濃度增加160kD位置上的密度增加。圖2-1-2A、B、B1顯示Lipo作為載體對siROCK2轉染PC12細胞的影響,Lipo/siROCK2組的轉染效率為69.86%,而siROCK2組的效率和對照組的效率分別為0.66%和0.59%。圖2-1-2C顯示siROCK2最佳轉染時間為48h,圖2-1-2D顯示siROCK2最佳轉染濃度為100nM的siROCK2, Lipo/siROCK2能夠顯著沉默ROCK2表達。圖2-1-2E siNC干擾對ROCK2的表達沒有影響。圖2-1-3A、A'顯示Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測細胞凋亡,結果顯示Lipo/siROCK2預處理的凋亡率與METH組相比減少了52.38%,p0.001,n=3。Lipo/siROCK2組相比Lipo2000或Lipo/siNC處理組相比,可明顯的減少PC12細胞的凋亡(F=876.56,*P0.001,n=3,)。這些結果表明,抑制ROCK2表達可減少METH誘導的PC12細胞的凋亡。圖2-1-3B、B’顯示TUNEL染色檢測凋亡,2.0mM METH處理的PC12細胞TUNEL陽性的細胞數量是對照組的8.9倍,*P0.01。Lipo/siROCK2預處理2.0mM METH組與2.0mM METH單獨處理組相比,TUNEL陽性的細胞數量減少60.2%,P0.01,接受100nM的siNC預處理組TUNEL陽性的細胞數量卻沒有明顯變化。Lipo/siROCK2預處理組缺乏用箭頭所示的典型的凋亡環(huán)形核結構。圖2-1-4顯示,METH+siROCK2組ROS比率與METH組以及METH+siNC組比分別降低了5.3%以及5.1%(*p0.05,n=3),認為ROCK2抑制可以有效降低METH導致PC12細胞中ROS增加。圖2-1-5A顯示RhoA的mRNA水平隨METH的濃度增加而增加,具有濃度依賴性。2mM的METH處理組RhoA的mRNA比Con組增加了71.84%,**p0.05,n=3。圖2-1-5B顯示,尚不能認為siROCK2的使用與METH使用的交互效應對RhoA的mRNA水平的升高有影響(F=42.32,*p0.05,n=3)。認為METH處理的PC12細胞中,ROCK2的激活可能與RhoA轉錄水平增加有關。圖2-1-5C1Western blot結果顯示抑制ROCK2與其逆轉細胞凋亡的機制相關。圖2-1-5C2顯示,METH+siROCK2組p-Akt/Akt比率與METH+Lipo組相比增加了51.0%,p0.001,n=3。認為ROCK2的抑制可增加METH導致PC12細胞中降低的p-Akt/Akt比率。METH+Lipo組p-Akt/Akt比率與Con組相比降低42.0%,*p0.01,n=3。認為抑制ROCK2可提高METH處理的PC12細胞中p-Akt/Akt比率。從而促進PC12細胞的存活。圖2-1-5C3顯示METH+Lipo組cleave PARP/PARP比率與Con組增加了131%,**p0.001,n=3,認為METH使用導致PC12細胞中PARP的分裂增力。METH+siROCK2組cleave PARP/PARP比率與METH+Lipo組比無統(tǒng)計意義,#p0.05,n=3。尚不認為siROCK2可減少METH導致增加的cleave PARP/PARP比率。圖2-1-5C4顯示METH+Lipo組ctive-capspase3與Con組相比增加了200%,**p0.001,n=3,認為METH使用導致PC12細胞中active-capspase3的增加具有統(tǒng)計學意義。METH+siROCK2組active-capspase3與METH+Lipo組相比無統(tǒng)計學差異,#p0.05,n=3,尚不認為抑制ROCK2是通過降低caspase3激活這一途徑保護神經元。以上說明ROCK2抑制對METH導致PC12細胞的凋亡可能通過通過提高p-Akt/Akt比例,而不是通過抑制METH導致caspase3的激活以及PARP的分裂途徑。圖2-1-6顯示METH處理導致樹突解體和突起長度的縮短。然而,PC12形態(tài)的變化在METH+Lipo/siROCK2組中得到恢復。圖2-1-7顯示.抑制ROCK2可部分恢復METH導致原代黑質神經元樹突分叉數目的減少以及神經突長度的縮短。圖2-1-8顯示干擾ROCK2可部分恢復METH導致原代黑質神經元樹突棘的密度的降低。圖2-1-9A顯示干擾ROCK2可部分逆轉METH導致原代黑質神經元的輪廓坍塌。圖2-1-9B1、B2METH+Saline組的p-MLC/MLC比率與Con/Saline組相比增加54.0%,**p0.001,n=3,認為METH所導致原代黑質神經元中p-MLC/MLC比率增加具有統(tǒng)計學意義。結果表明干擾ROCK2可降低METH所導致增加的p-MLC/MLC比率,從而增加F-actin的穩(wěn)定性,有利于增加細胞骨架的穩(wěn)定性,維持細胞輪廓。 第二章第二節(jié)圖2-2-1免疫熒光以及western blot顯示在體模型上ROCK2在METH處理后Str、SN以及PFc區(qū)增加明顯,而Hip增加不明顯。圖2-2-2open field檢測大鼠自主運動行為結果顯示,分組與觀察時間的交互效應不顯著F=0.16,#P0.05,認為分組間的差別不隨觀察時間的不同而改變。采用調整的基于估計邊緣值的LSD法進行不同分組間指標的多重指標值的多重比較,Con組、Fasudil組、METH組以及Fasudil組間均無顯著性統(tǒng)計學差異P0.05。METH停藥后48h與對照組相比,大鼠自主活動的在各組以及各時間段變化并不具有統(tǒng)計學差異,并未體現(xiàn)出Fasudil對METH損害的大鼠自主行為有保護作用。圖2-2-3Western blot顯示Fasudil可部分抑制METH導致Str以及SN區(qū)中ROCK2的增加,說明抑制ROCK2的METH模型構建成功。圖2-2-4中TUNEL染色顯示末次METH使用后48h, METH組與Con組比并未在PFc、Str、Hip以及SN區(qū)發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細胞的增加,不認為此種建模方式導致大鼠神經細胞的凋亡。圖2-2-5中尼氏染色顯示末次METH使用后48h,MEETH組與Con組比PFc、Str、Hip以及SN區(qū)發(fā)現(xiàn)尼氏染色陽性的細胞減少,認為此種建模方式導致大鼠神經細胞的損傷。圖2-2-6TH染色顯示末次METH使用后48h, Str區(qū)TH-ir的面積大量減少,Fasudil的使用可以逆轉這一改變；SN區(qū)TH-ir的神經元數目大量減少,Fasudil的使用可以逆轉這一改變。圖2-2-7免疫組化結果顯示METH可以降低DAT表達以及升高Grp78、Bax、CDK5的表達,而對激活的caspase3改變不明顯。Fasudil聯(lián)合METH使用可部分恢復METH對DAT、Bax、Grp78及CDK5四個指標的改變。提示抑制ROCK2可能通過抑制線粒體損傷、內質網應激、氧化應激對METH損傷上神經系統(tǒng)進行保護。 結論： 第一章 1.體內模型中證實GSTP1表達在METH處理后表達降低。 2.GSTP1不在METH處理后的表達降低是由部分由iNOS介導。 3.GSTP1對METH導致的氧化應激有抑制作用。 4.CDK5可能為GSTP1在METH神經毒性作用機制的下游因子。 5.成功構建SN及SN投射區(qū)區(qū)GSTP1過表達的大鼠模型。 第二章 1.ROCK2表達的增高具有METH濃度依賴性。 2.成功合成高效能的siROCK2,并能成功敲低PC12細胞以及原代中腦神經元中ROCK2的表達。 3.抑制ROCK2能部分逆轉METH導致PC12細胞的凋亡。 4.抑制ROCK2能部分降低METH所導致氧化應激。 5.抑制ROCK2通過增加Akt磷酸比例減輕METH導致的凋亡,而并非通過抑制caspase3的激活及PARP的分裂。 6.抑制ROCK2能逆轉METH導致的PC12細胞形態(tài)異常以及原代黑質神經元細胞骨架的不穩(wěn)定性,維持樹突的分支以及長度。其機制可能是通過提高降低p-MLC/MLC去實現(xiàn)的。 7.體內實驗證實METH處理后ROCK2能在PFc、SN、Str區(qū)明顯增加,而在Hip區(qū)增加不明顯。 8.在體實驗證實抑制ROCK2可保護METH損傷的TH-ir陽性神經末梢以及胞體。 9.尼氏體的損傷以及TH染色可能比TUNEL染色檢測凋亡更敏感地反應METH導致的神經損傷。 10.在體實驗提示抑制ROCK2可能通過維持多巴胺的轉運水平、抑制線粒體損傷、內質網應激以及氧化應激的途徑發(fā)揮的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：D919.4

【參考文獻】

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2 劉志民,呂憲祥;我國藥物濫用監(jiān)測概述[J];中國藥物依賴性雜志;2004年01期

3 徐健雄;段煉;王達平;劉玉平;;甲基苯丙胺所致精神病性障礙的臨床特點分析[J];中國藥物依賴性雜志;2012年05期

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本文編號：2101792