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體外培養(yǎng)成人成骨細胞-調度自動化論文

發(fā)布時間:2014-07-24 13:48
調度自動論文:

關鍵字: 調度自動論文發(fā)表    制造自動化技術論文     電力調度員論文 

   摘 要:目的:改良成人成骨細胞消化培養(yǎng)方法,以滿足在細胞學水平進行骨代謝性疾病研究的需要。方法:取無菌骨碎片,先用胰蛋白酶消化多次,以去除血細胞和成纖維細胞;骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后,再次使用胰蛋白酶消化,得到大量純凈成骨細胞。細胞長至匯合后生成黑色結節(jié)。分別采用NPP底物法、125I標記放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型膠原順序沉淀抽提、SDS-PAGE還原電泳法測定細胞上清中成骨細胞主要特征性分泌物:大量堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原。 結果:黑色結節(jié)經(jīng)四環(huán)素染色,熒光顯微鏡下觀察為骨結節(jié)特征性的金黃色。成骨細胞上清中AKP分泌量為(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量為(1.875±0.549) ng/ml,明顯高于成纖維細胞(P<0.01)?蓹z測到Ⅰ型膠原而無Ⅲ型膠原。結論:此改良方法可以在短期內得到大量性狀穩(wěn)定成骨細胞,同時避免成纖維細胞混入。
   關鍵詞:成骨細胞 堿性磷酸酶 骨鈣素 膠原
  成骨細胞特征性表型為分泌骨鈣素(OCN)、大量堿性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型膠原’而無Ⅲ型膠原分泌[1]。我們采用改良骨組織消化培養(yǎng)方法,將骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后’再用胰蛋白酶消化’加快骨細胞的釋放。經(jīng)形態(tài)學觀察及特征性分泌物檢測證實’獲得成骨細胞數(shù)量多,并與纖維細胞有明顯區(qū)別。
  材料與方法
  一、液體的配制
  0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液,抽濾滅菌。培養(yǎng)液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL’Grand Island’NY)’加20%滅活新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml。低血清培養(yǎng)液為5%滅活新生牛血清,其余同培養(yǎng)液。使用25 cm2培養(yǎng)瓶(NUNCLON’Denmark)。
  二、骨組織片消化
  取骨科手術中獲得的無菌骨碎片’徹底去除骨膜及軟組織;用無菌Hank′s液沖洗3次’剪碎至體積小于1mm3;Hank′s液多次沖洗至骨片發(fā)白’放入錐形瓶內’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍體積)’37℃水浴中消化(30 min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培養(yǎng)液中’置37℃ CO2培養(yǎng)箱內2~3 d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30 min’上清液經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后’離心10 min(1000 r/min)’去掉上清液’沉淀物用培養(yǎng)液打勻’接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內’重復3次’直至離心后無沉淀物為止。
  將消化后的骨片浸泡于培養(yǎng)液中’2~3 d后’重復上述胰蛋白酶消化步驟’仍有細胞釋放’根據(jù)所需細胞量’可重復數(shù)次。接種后培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液較渾濁’10 h后即有貼壁細胞’72 h后’細胞完全貼壁’可沖洗、換液。此后隔日換液。取第二、三代細胞,消化后,以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶中,每瓶4 ml’5 d后換低血清培養(yǎng)液6 ml,24 h后收集上清液,分裝于5個離心管內,-18℃保存’用于檢測。
  三、成骨細胞特征性鑒定
  以皮膚成纖維細胞作為對照,鑒定實驗所得成骨細胞。
  1.形態(tài)學觀察:除常規(guī)形態(tài)學觀察外,采用趨骨性熒光素標記細胞培養(yǎng)生成結節(jié)。細胞培養(yǎng)瓶內加入四環(huán)素’使終濃度為50 μg/ml’培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 h’換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h,經(jīng)Hank′s液沖洗3次’乙醇梯度脫水’固定’Olympus-Vanox-T顯微鏡落射熒光觀察。
  2.成骨細胞上清液AKP檢測:采用磷酸對硝基苯酯二鈉鹽(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt’NPP’上海麗珠東風公司)比色法[2]’無色p-NPP與AKP在37℃水浴中反應生成黃色對硝基苯p-Nitrophenol’經(jīng)405 nm波長比色’測得OD值’換算成國際單位。
  3.成骨細胞上清液中骨鈣素檢測:采用BGP放免試劑盒(北京東亞免疫技術研究所)檢測[3]。根據(jù)放射免疫競爭結合原理,125I標記OCN和樣品所含OCN與OCN抗體競爭結合,使用分離劑使結合抗體沉淀,4℃離心后,γ計數(shù)器測定沉淀物cpm數(shù),根據(jù)標準品曲線得到樣品OCN含量。
  4.成骨細胞上清液中膠原抽提及檢測:采用中性、酸性Nacl溶液順序沉淀抽提[4],SDS-PAGE垂直板還原電泳法[2]。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝膠板固定于垂直板電泳槽[5]。電泳液為0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8);樣品液為0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚蘭;染色液為0.25%考馬斯亮藍R250、25%異丙醇和10% HAC;脫色液為5%異丙醇和8%HAC。樣品解凍后’放55℃水浴中變性1 h’加入樣品緩沖液50 μl’每個樣品點2孔’每孔加樣20 μl’另加Ⅰ、Ⅲ型膠原標準品’50 mA恒定電流電泳1 h后’每個樣品第1孔內加入100 μl 20%β巰基乙醇(β-mercaptoethanol,Sigma)樣品緩沖液’靜置1 h后’13 mA恒定電流電泳12 h’染色液染色1 h’脫色液脫色24 h’拍照片。
討 論
  一、成骨細胞體外培養(yǎng)方法的建立
  早在20世紀60年代’Peck和Birge[8]開始用膠原酶消化骨片’體外培養(yǎng)成骨細胞獲得成功;1975年’Wong等[9]采用多次膠原酶消化’使培養(yǎng)的成骨細胞得到純化。1985年’Robey和Termin等[10]采用低Ca2+培養(yǎng)液培養(yǎng)骨片獲得成骨細胞’經(jīng)過鑒定’比酶消化法得到的細胞更加純化。本實驗改良上述方法’先使用比膠原酶更便宜的胰蛋白酶進行多次消化’胰蛋白酶僅能消化骨小梁表面細胞周圍的基質,而對于埋藏于骨基質中的大量靜止骨細胞無作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨組織中殘留的血細胞、成纖維細胞、骨髓細胞及部分成骨細胞和骨細胞,因此棄之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化,無細胞釋放,證實骨片中僅含有埋藏于基質中的骨細胞,筆耕文化傳播,而無其它細胞。骨片在培養(yǎng)液中浸泡后,靜止骨細胞通過骨小管內細胞縫隙連接[11]’感知外界溶液濃度變化’特別是鈣離子濃度變化[10]’開始活躍起來’通過骨細胞性溶骨作用[12]釋放出來’在骨片周圍形成貼壁細胞’但一般要經(jīng)過2周以上時間’且貼壁細胞僅出現(xiàn)于骨片周圍[10]’數(shù)量有限。在骨細胞釋放出來以前’再次使用胰蛋白酶可大大加速其釋放速度和數(shù)量’既代替了膠原酶的作用’又可避免成纖維細胞的混入。消化細胞接種后,經(jīng)2~3周培養(yǎng)可達匯合’取第2、3代細胞檢測,可避免長期培養(yǎng),反復傳代后引起細胞分化和表型的改變。本實驗結果顯示,此方法簡單、實用,并可獲得足夠數(shù)量的成骨細胞。
電力系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)分析論文  



本文編號:7891

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