發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 08:35

　　 棉花(Gosypium spp.)屬于錦葵科。棉花植株會(huì)受到不同病原體的感染,如真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲和其他害蟲等。它引起了棉花許多疾病。此前有報(bào)道稱,來(lái)自真菌的48個(gè)物種導(dǎo)致了世界上20種不同危害癥狀類型(Wikipedia2015)。炭疽病是棉花植株中最具破壞性的病害之一。棉花炭疽病是由病原真菌Colletotrichum gossypii Southw引起的病害,它被認(rèn)為是棉花作物中最重要的病害,侵染植株的不同部分,最終導(dǎo)致棉花作物完全受損。炭疽菌(C.gossypii)是膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)復(fù)合種群的一員。然而,C.gloeosporioide復(fù)合種群具有較高的遺傳相似性,這使得對(duì)C.gossypii的診斷具有挑戰(zhàn)性。此外,不同地理區(qū)域的C.gossypii的孢子大小和形態(tài)特征也各不相同。本研究中,我們考察了中國(guó)不同棉花種植區(qū),并分離了不同的C.gossypii菌株。進(jìn)一步對(duì)分離到的不同菌種的形態(tài)、生長(zhǎng)模式和致病性進(jìn)行研究。同時(shí),還對(duì)它們的寄主多樣性進(jìn)行探索。我們發(fā)現(xiàn),不同的C.gossypii菌株具有不同的形態(tài)特征,如其中一些菌株的生長(zhǎng)速率存在差異,我們也觀察到不同C.gossypii菌株在孢子形態(tài)和大小上也存在差異。大多數(shù)C.gossypii菌株形成了具有均勻或不規(guī)則邊緣的菌落,菌絲是白色至淺灰色,孢子通常在生長(zhǎng)于菌落表面的中心;不同C.gossypii菌株在孢子顏色仍存在差異,但大部分孢子的顏色呈淡紅色至橙紅色;分生孢子大部分呈橢圓形,少數(shù)呈梭形。子囊殼堅(jiān)硬,深棕色到黑色,不易破裂。它可能分散在菌落內(nèi)部,也可能形成聚集成條狀或成排。用顯微鏡觀察,每一顆子囊中存在單核孢子囊和8個(gè)子囊孢子。單細(xì)胞的子囊孢子是透明的、橢圓形的,還有一點(diǎn)彎曲。分生孢子長(zhǎng)度9.43-10.67μm和寬度2.7-3.2μm。在不同C.gossypii菌株的生長(zhǎng)速度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C.gossypii菌株CG01,CG09、CG12 CG14,CG22和CG26表現(xiàn)出快速生長(zhǎng)(5.0-7.1 mm/d),菌株CG04,CG11,CG16,CG18,CG21,CG23,CG25 和 CG27 顯示中等生長(zhǎng)速度(3.9 到 5.9mm/d)和菌株 CG07 CGCG10,CG13,CG15 CG17,CG19 和 CG24 增長(zhǎng)速度最慢(2.3 到 5.0 mm/d)。在致病性試驗(yàn)中,我們觀察到不同的C.gossypii菌株的致病能力也不同。大多數(shù)C.gossypii分離菌株都能侵染棉花的抗病和易感品種葉片,并引起疾病。接種CG01、CG05、CG09、CG12、CG14、CG18的棉花葉片在接種后5天內(nèi)出現(xiàn)病征,而與其它分離的C.gossypii菌株接種后,病情發(fā)展較慢。CG02、CG04、CG13、CG14、CG15、CG17、CG22、CG24、CG26、CG27菌株接種抗病棉花品種葉片后的發(fā)病速度,比接種易感棉花品種葉片的發(fā)病速度慢。CG04、CG17、CG22菌株接種的易感病棉花品種葉片也比抗性品種更迅速地出現(xiàn)病癥。然而,在接種CG02、CG15、CG20或CG24的同時(shí),抗性和易感的棉花品種都只出現(xiàn)了少數(shù)病癥。用其它C.gossypii菌株接種的抗病和易感棉花品種葉片表現(xiàn)出中等的病癥。在寄主范圍試驗(yàn)中,我們分析了一些C.gossypii菌株在不同的宿主中具有引起感染的能力。在我們的實(shí)驗(yàn)中,C.gossypii成功地感染了芒果(Mangifera indica)、橡膠樹(Ficus tica)和不同的番茄(Solanum lycopesicum)葉片。但是,番石榴葉子(Psidium guajava),馬鈴薯塊莖(Solanum tuberosum),燈籠椒(Capsicum annum),香蕉樹果實(shí)(Musa acuminatata)胡椒(Capsicum baccatum),胡蘿卜(Daucus carota)能夠抵抗 C.gossypii。除了芒果葉(Mangifera india)、橡膠樹葉(Ficus tica)和不同的番茄葉(Solamnum ycopersicum)外,其他植物都出現(xiàn)癥狀。在這些植物中,番茄對(duì)C.gossypii菌株最敏感,而橡膠樹葉片最不敏感。C.gossypii侵染寄主后在寄主植物上產(chǎn)生了不規(guī)則形狀的炭疽病斑點(diǎn)。因此,在不同地區(qū)棉花種植區(qū),C.gossypii存在不明確的特性,促使我們開發(fā)了一種分子診斷檢測(cè)方法。為了克服形態(tài)學(xué)和致病性所產(chǎn)生的歧義,我們?cè)O(shè)計(jì)了一套以β-tubulin(TUB)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的引物。在試驗(yàn)過(guò)程中,我們比較了 77個(gè)來(lái)自NCBI和我們分離的27個(gè)菌株的TUB基因序列,結(jié)果顯示,所有這些分離株的TUB基因具有97%以上相似,只有單核苷酸之間的差異。因此,我們只關(guān)注單核苷酸現(xiàn)象。我們?cè)噲D在序列中找到一種在所有C.gossypi 菌株(即來(lái)自中國(guó)不同省份的27株C.gossypi 菌株和GenBank的C.gossypii分離株)中具有100%的相似的序列區(qū)域,同時(shí)與其它Colletotrichum物種沒(méi)有相似之處。單核苷酸多態(tài)性(SNP)的差異被放置在前引物SPSCG/F的5'端。用于設(shè)計(jì)引物對(duì)的SNP是開始密碼子的一部分,但在其它屬的成員中缺失。SPSCG/F和SPSCG/R引物能夠擴(kuò)增約294個(gè)bp的產(chǎn)物。SPSCG/F和SPSCG/R引物對(duì)只能擴(kuò)增C.gossypii和混合有C.gossypii的Colletotrichum DNA,即使C.gossypii DNA濃度比其它物種低10倍。我們采用不同的Colletotrichum物種和其它一些真菌,用引物SPSCG/F和SPSCG/R進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果表明,SPSCG/F和SPSCG/R引物對(duì)C.gossypii是高度特異性的,這一引物只能擴(kuò)增到C.gossypii的TUB區(qū)域,而其它物種無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增。我們還檢查了物種特異性引物(SPSCG/F,SPSCG/R)的敏感性。結(jié)果顯示,物種特異性引物SPSCG/F和SPSCG/R是高度敏感的,它在與其它真菌基因組DNA進(jìn)行10倍稀釋的情況下,也能擴(kuò)增出了 C.gossypii DNA。由于寄主范圍廣,在對(duì)C.gossypii所引起的作物病害進(jìn)行防治的過(guò)程中,應(yīng)當(dāng)克服對(duì)多作物、農(nóng)民和環(huán)境的不利影響。由于缺乏有效的不損害農(nóng)民的健康和環(huán)境的殺菌劑,因此,我們對(duì)C.gossypii的生物防治進(jìn)行研究。本系列實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估不同根際細(xì)菌菌株的拮抗活性。為此目的,我們分離、純化和保存了 48種不同的根際細(xì)菌菌株,用于C.gossypii所引發(fā)的炭疽病的生物防治。在篩選過(guò)程中,我們觀察到31株根際細(xì)菌菌株具有拮抗活性,其他17株菌株沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)C.gosypii的拮抗作用。在31個(gè)不同的根際細(xì)菌分離菌株中,OE-4具有最高的拮抗作用;CDl、CE3,CD4,CE4B,CD6,PD2,PE3,PD3,TD1 和 OE5 為適度拮抗作用;CD2,CD3,CE2,CE1A,CE2A,CE5A,CE6A,CE8A,CE9A,CE2B,CE3B,CD2A,TE1,TE2,TE3,OD2,OE1,OE2 和 OE3 為輕度拮抗作用;而 CE3ACE4A,CE7A,CE1B,CE5B,CE6B,CD5,CD7,CD8,CD9,CD1A,CD3A,CD5A,PD1,PE1,PE2和OD1則沒(méi)有拮抗作用。同時(shí),我們還對(duì)12種最有前途的抗真菌根際細(xì)菌進(jìn)行了定量篩選,并對(duì)真菌菌絲體的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),CE1和OE-04是最有希望的抗真菌根際分離株。選擇CE1和OE-04作為高度拮抗劑,選擇CD1,CE3,CD4,CE4B,CD6,PD2,PE3,PD3,TD1 和 OE5 作為中度拮抗劑。發(fā)現(xiàn)CD6拮抗活性最低。因此,為了進(jìn)一步研究,我們使用了高度拮抗的根際細(xì)菌CE1和OE-04。根據(jù)它們的細(xì)胞形態(tài),菌落結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)特征鑒定了根際菌株CE1和OE-4。在生化和生長(zhǎng)特性試驗(yàn)中,兩株根際細(xì)菌菌株CE4和OE-4均顯示陽(yáng)性結(jié)果,而在55℃生長(zhǎng)試驗(yàn)中,菌株CE1為陰性,因此我們使用OE-4菌株進(jìn)一步研究。根據(jù)分子水平研究結(jié)果,根際菌株OE-04為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。我們使用地衣芽孢桿菌OE-04菌株分泌的生物表面活性劑抑制棉花炭疽病菌,并從48株根際細(xì)菌中篩選出該菌株。我們觀察到OE-4菌株分泌物能抑制真菌菌絲體,并且這些區(qū)域在菌絲體的外圍邊緣。我們注意到分泌物使棉花炭疽菌培養(yǎng)物產(chǎn)生了一些形態(tài)異常。在對(duì)照處理中,真菌菌絲體未損傷,拉伸且光滑,沒(méi)有任何改變。我們還探索了菌株0E-04分泌的生物表面活性劑的熱穩(wěn)定性和pH范圍以及毒性。結(jié)果表明,生物表面活性劑對(duì)棉炭疽菌具有最大的拮抗活性。體外研究得出結(jié)論,生物表面活性劑可通過(guò)抑制棉花炭疽菌的孢子萌發(fā)而降低真菌活性。而且,生物表面活性劑也具有很廣泛的pH和溫度范圍。我們觀察到生物表面活性劑在pH5～10范圍內(nèi)、溫度從室溫至100℃范圍內(nèi)都有抗真菌活性。我們分析了在pH值低于5和超過(guò)10時(shí),地衣芽孢桿菌OE-04的生物表面活性劑的抗真菌活性顯著降低,并且分析了在100℃之后針對(duì)炭疽病菌的抗真菌活性顯著降低。不同處理的寄主植物中H2O2的產(chǎn)生表明0E-04菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑具有控制該病害的能力,而且也有助于提高寄主植物的免疫力。我們還觀察到地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的生物表面活性劑對(duì)斑馬魚(Daniorerio)的毒性。我們注意到生物表面活性劑對(duì)最大濃度的影響最小。我們觀察到,地衣芽孢桿菌菌株OE-4的生物表面活性劑具有作為棉花炭疽病的生物防治劑的巨大潛力。根據(jù)數(shù)據(jù)分析,在用或不用菌株OE-04產(chǎn)生的生物表面活性劑處理時(shí),觀察到棉炭疽病菌的致病活性存在顯著差異。T1治療顯示出最大的感染,T2顯示與T1相比最低的感染。T3和T4顯示沒(méi)有疾病癥狀。為了檢查對(duì)棉花炭疽菌菌株的殺菌敏感性,使用體外菌絲體生長(zhǎng)測(cè)定法評(píng)估了咪鮮胺,phenamacril,代森錳鋅,丙環(huán)唑,苯菌靈,嘧菌環(huán)胺,嘧菌酯,多菌靈和噻苯唑。我們觀察到不同處理濃度對(duì)菌絲體質(zhì)量和產(chǎn)孢量的影響較大。當(dāng)我們進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí),我們也注意到,如果我們用添加了殺菌劑的培養(yǎng)物接種真菌時(shí),發(fā)現(xiàn)第一次接種和第二次接種有顯著差異。本研究是對(duì)棉花炭疽病從病原鑒定到防治的較為全面研究,對(duì)棉花炭疽病的生物防治具有重要意義。地衣芽孢桿菌OE-04的表面活性劑可以作為替代化學(xué)農(nóng)藥防治棉花炭疽病的重要生物防治因子。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.62
【文章目錄】：
Abstract
摘要
1. Introduction
    1.1 Cotton Anthracnose
    1.2 Geographical distribution
    1.3 Disease description
    1.4 Colletotrichum gossypii
    1.5 Taxonomical distribution
    1.6 Identification techniques
    1.7 Molecular identification
    1.8 Polymerase chain reaction （PCR）
    1.9 Quantification of PCR
    1.10 Real-time PCR
    1.11 DNA probing technology
    1.12 Molecular identification of Colletotrichum species
    1.13 Biological control
    1.14 History
    1.15 Importation
    1.16 Augmentation
    1.17 Conservation
    1.18 ROS molecules
2. Material and Method
    2.1 Sterilization of Glassware
    2.2 Disease sample collection
    2.3 Isolation of pathogen
    2.4 Maintaince of culture
    2.5 Morphological studies
    2.6 Molecular study
        2.6.1 DNA isolation and purification
        2.6.2 PCR Amplification
    2.7 Pathogenicity tests
    2.8 Host range of Colletotrichum gossypii
    2.9 Design of Colletotrichum gossypii-specific PCR primers
        2.9.1 PCR-based DNA amplification using SPSCG/F and SPSCG/R primers
        2.9.2 Specificity of primers and sensitivity of PCR
    2.10 DNA modeling and phylogenetic analysis
    2.11 Isolation of Rhizobacteria
    2.12 Isolation of Ectophyte Rhizobacteria
    2.13 Isolation of Endophyte Rhizobacteria
    2.14 Purification of Isolated Rhizobacteria
    2.15 Screening for antifungal activity against Colletotrichum gossypii
    2.16 Qualitative Screening
    2.17 Quantitative Screening
        2.17.1 Screening of Rhizobacteria for Indole Acetic Acid Production
        2.17.2 Screening of Rizobacteria for Phosphorous Solubilization
    2.18 Identification of Most Promising Rhizobacteria
        2.18.1 Gram Staining
        2.18.2 Spore Staining
        2.18.3 Catalase Test
        2.18.4 Starch Hydrolysis Test
        2.18.5 Voges Proskauer Test
        2.18.6 Cell Diameter Measurement
        2.18.7 Citrate Utilization Test
        2.18.8 Growth In 6.5% Sodium Chloride Lb Broth Media
        2.18.9 Growth at 55℃
    2.19 Molecular identification
    2.20 Fermentation and Extraction of metabolites
    2.21 Antifungal assessment of extracted metabolites
    2.22 Heat stability and pH range of extracted metabolites
    2.23 EC50 （concentration required to obtain a 50% antifungal effect） determination
    2.24 ROS accumulation in cotton leaves
    2.25 Toxicity test
    2.26 Compare the fungicide and antifungal metabolites of B. licheniformis resistant against Colletotrichum gossypii
    2.27 Bacillus licheniformis strain OE-04 prevents disease infection on cotton seedling
3. Results
    3.1 Strain Isolation
    3.2 Morphological Study of Colletotrichum gossypii isolates
    3.3 Molecular identification
    3.4 Pathogenicity evaluation
    3.5 Host range of Colletotrichum gossypii
    3.6 Sequence variation in the TUB region and the design of Colletotrichum gossypii-specific primers703.7 Specificity of primers and sensitivity of PCR
    3.8 DNA modeling and phylogenetic analysis
    3.9 Isolation of Rhizobacteria
    3.10 Qualitative Screening of Rhizobacteria for Antifungal Activity
    3.11 Quantitative Screening of Rhizobacteria for Antifungal Activity
    3.12 Biochemical properties of most promising antifungal rhizobacterial
    3.13 Molecular identification
    3.14 Biological activities of the OE-04 strain biosurfactant
    3.15 Effect of Bacillus licheniformis strain OE-04 on Fungal Hyphae
    3.16 Temperature, pH stability of OE-04 secreted metabolites
    3.17 ROS accumulation in cotton leaves
    3.18 Toxicity effect of antifungal substance on zebra fish
    3.19 Compare the fungicide and antifungal metabolites of B. licheniformis resistant against C. gossypii
    3.20 Bacillus licheniformis strain OE-04 prevent disease infection on cotton seedling
4. Discussion
5. Conclusion
    5.1 Anthracnose
    5.2 Morphological study
    5.3 Pathogenicity and host range
    5.4 Molecular detection of C. gossypii
    5.5 Biological control of C. gossypii
    5.6 Fungicide sensitivities of C. gossypii
Published articles
Unpublished articles
References
Acknowledgement


本文編號(hào)：2880524