發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 18:14

　　 家蠶蛹作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白源,因其營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白含量高、味道鮮美,一直是人們喜愛(ài)的食物之一。但是由于家蠶蛹中存在一些致敏原導(dǎo)致在實(shí)際生活中有少數(shù)人會(huì)發(fā)生食入家蠶蛹過(guò)敏的情況,這不但制約了家蠶蛹在食品上的應(yīng)用,還危害著人們的健康。因此深入研究家蠶蛹內(nèi)的致敏原種類和致敏機(jī)理,對(duì)開發(fā)培育安全的家蠶蛹品種具有重要的意義。本文旨在分析不同品種家蠶蛹致敏原蛋白表達(dá)水平的差異,從種質(zhì)資源的源頭篩選開發(fā)出致敏性較低且適合食用的家蠶蛹品種,主要研究結(jié)果如下:1、家蠶蛹致敏原基因轉(zhuǎn)錄水平的差異研究。選擇102份不同品種的蠶蛹作為供試材料,利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR),通過(guò)檢測(cè)不同品種家蠶蛹中7種主要致敏原基因(家蠶假定表皮蛋白30、胰凝乳蛋白酶抑制劑、小熱休克蛋白20.8、卵黃原蛋白、幾丁質(zhì)酶、30K家族蛋白、丙糖磷酸異構(gòu)酶)的轉(zhuǎn)錄水平,初步篩選出致敏原基因轉(zhuǎn)錄水平較低的家蠶蠶蛹品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1007、4034、4020、2016、2030的蠶蛹體內(nèi)致敏原基因的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低。2、家蠶小熱休克蛋白20.8(HSP 20.8)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI-8A)的原核表達(dá)及抗體的制備。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增HSP 20.8和CI-8A基因,連接pET-28a構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入至大腸桿菌BL21細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示:擴(kuò)增得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列一致,成功構(gòu)建HSP 20.8和CI-8A的原核表達(dá)載體,獲得大小分別為28 KDa和47 KDa左右的重組蛋白,符合預(yù)測(cè)結(jié)果,同時(shí)成功制備抗體,效價(jià)分別為1:51200和1:25600。3、家蠶蛹致敏原蛋白水平的表達(dá)差異研究。提取各品種的家蠶蛹總蛋白,利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)家蠶蛹總蛋白進(jìn)行分離,經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜后利用免疫印跡方法(Western-blot)將上述制備的抗體與分離后家蠶蛹總蛋白進(jìn)行反應(yīng),從而檢測(cè)蠶蛹中致敏原蛋白的含量。結(jié)果顯示:2025品種的家蠶蛹中致敏原HSP 20.8和CI-8A的含量最低,認(rèn)為該品種可以作為相對(duì)安全可食用性候選蠶蛹品種進(jìn)行培育。
【學(xué)位單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S881.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 致敏原研究進(jìn)展
        1.1.1 致敏原概述
        1.1.2 食物過(guò)敏的機(jī)制
        1.1.3 食物過(guò)敏動(dòng)物模型研究
        1.1.4 致敏原的檢測(cè)技術(shù)
    1.2 致敏原致敏的機(jī)理
        1.2.1 致敏原的抗原表位
        1.2.2 致敏原的分子模擬
    1.3 家蠶致敏原的研究進(jìn)展
        1.3.1 家蠶致敏原的致敏方式
        1.3.2 家蠶致敏的臨床表現(xiàn)
        1.3.3 家蠶致敏原的致敏成分
        1.3.4 家蠶蛹致敏原分子生物學(xué)研究
    1.4 本研究的目的與意義
    1.5 本研究的主要內(nèi)容
第2章 家蠶蛹致敏原基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備和試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 家蠶蛹RNA的提取
        2.2.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量分析
    2.3 結(jié)果與分析
    2.4 討論
第3章 原核表達(dá)及多克隆抗體制備
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.1.1 試劑和實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        3.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
        3.2.3 目的片段膠回收
        3.2.4 目的基因與載體的酶切、純化、連接
        3.2.5 轉(zhuǎn)化及克隆測(cè)序
        3.2.6 重組DNA的篩選和鑒定
        3.2.7 誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.8 His柱洗脫
        3.2.9 抗體制備
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 HSP20.8和CI-8A基因的克隆
        3.3.2 原核表達(dá)及抗體制備
    3.4 討論
第4章 家蠶蛹致敏原在蛋白水平表達(dá)的差異
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 設(shè)備與試劑
        4.1.2 常用試劑和緩沖液的配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 家蠶蛹總蛋白的提取
        4.2.2 蠶蛹總蛋白濃度定量
        4.2.3 SDS-PAGE分析
        4.2.4 Western-blot檢測(cè)
    4.3 結(jié)果與分析
    4.4 討論
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的論文
致謝

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