根腐病是藍(lán)莓生產(chǎn)當(dāng)中的重要病害之一,不僅影響著藍(lán)莓的品質(zhì)和產(chǎn)量,還能夠使植物整株死亡,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。隨著藍(lán)莓種植不斷向新的地區(qū)發(fā)展,不同的種植環(huán)境、品種布局與種苗來(lái)源也關(guān)系著病害發(fā)生的多樣性。本實(shí)驗(yàn)室2013年-2017年對(duì)我國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的藍(lán)莓根腐病,分別由麗赤殼屬真菌與鐮孢屬真菌引起,兩種類型根腐病的癥狀類似,均是侵染植株根部,導(dǎo)致葉片及枝條干枯,并最終造成整株死亡。為明確引起藍(lán)莓根腐病的病原菌種類,并為此類病害的防治提供理論基礎(chǔ),本研究結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育種群研究技術(shù),鑒定了分離自藍(lán)莓根部的病原菌,比較了不同病菌的生物學(xué)特性,評(píng)價(jià)了不同藍(lán)莓品種對(duì)根腐病菌的抗感差異,集成與研發(fā)了藍(lán)莓根腐病菌PCR快速檢測(cè)技術(shù)。研究結(jié)果如下:1.經(jīng)采集分離與鑒定共獲得4種藍(lán)莓根腐病菌經(jīng)采集分離純化,本研究共獲得4株藍(lán)莓根腐病代表菌株,鑒定結(jié)果顯示菌株HNCS02Bb為木賊鐮孢菌Fusarium equiseti,HNCS02Da為F.commune,SDRS02Ba為F.oxysporum,菌株YNQJ01Aa為冬青麗赤殼Calonectria ilicicola。對(duì)得到的根腐病病原真菌進(jìn)行形態(tài)特征的觀察,鐮孢菌各供試菌株菌落形態(tài)多樣,各菌株均可從大型分生孢子的典型特征判斷屬于鐮孢菌屬,對(duì)代表菌株在PDA上25℃條件下培養(yǎng)7 d時(shí)的特征進(jìn)行描述:HNCS02Bb菌落白色至粉色,背面肉色至桃色;HNCS02Da菌落正面白色至紫色,背面通常產(chǎn)生紫色色素;SDRS02Ba菌落正面白色至紫色,背面產(chǎn)生紫色色素。分離到的麗赤殼屬真菌YNQJ01Aa,在PDA上25℃條件下培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑達(dá)到90 mm,菌落呈白色至黃色,背面白色至淡黃色,根據(jù)分生孢子棍棒型、兩端鈍圓的特征以及大小鑒定該菌為麗赤殼屬真菌。系統(tǒng)發(fā)育分析與鑒定:經(jīng)過(guò)ITS序列的BLAST結(jié)果分析表明,4株代表菌屬級(jí)別的分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)一致。進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育研究,麗赤殼屬的系統(tǒng)發(fā)育研究采用EF-1α,β-tubulin及Histone 3三段基因聯(lián)合,鐮孢菌屬采用EF-1α基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對(duì)4株藍(lán)莓根腐病代表菌株進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定。結(jié)果顯示,3株鐮孢菌代表菌株鑒定結(jié)果為HNCS02Bb為木賊鐮孢菌Fusarium equiseti(屬F.incarnatum-equiseti復(fù)合種),HNCS02Da為F.commune,SDRS02Ba為F.oxysporum(屬尖孢鐮孢菌復(fù)合種),麗赤殼屬菌株YNQJ01Aa為冬青麗赤殼Calonectria ilicicola,其無(wú)性態(tài)為寄生帚梗柱孢霉Cylindrocladium parasiticum。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)了一種由麗赤殼屬造成的莖部病害,經(jīng)鑒定其病原菌為Calonectria canadensis,無(wú)性態(tài)為Cylindrocladium canadense,該病原菌也用于后續(xù)PCR檢測(cè)試驗(yàn)中的驗(yàn)證。2.4種藍(lán)莓根腐病病原菌的生物學(xué)特性存在差異研究了不同氮源、碳源、不同培養(yǎng)基、光照與p H對(duì)藍(lán)莓根腐病4株代表菌株菌絲生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示:F.equiseti菌株HNCS02Bb,F.commune菌株HNCS02Da與F.oxysporum菌株SDRS02Ba在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑無(wú)顯著差異,C.ilicicola菌株YNQJ01Aa最適碳源為可溶性淀粉。HNCS02Da的最適氮源為半胱氨酸,HNCS02Bb的最適氮源為半胱氨酸和Na NO3,SDRS02Ba與YNQJ01Aa的最適氮源為Na NO3。4株供試菌株均在PDA,OA和藍(lán)莓汁培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)良好。HNCS02Da與SDRS02Ba的最適生長(zhǎng)溫度為25°C-30°C,YNQJ01Aa與HNCS02Bb的最適生長(zhǎng)溫度為25°C。3種光照條件對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)速率的影響不明顯。供試菌株在p H為4-8范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng),HNCS02Da在液體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較其他3株供試菌緩慢,HNCS02Bb適宜p H為6,SDRS02Ba最適p H為5,YNQJ01Aa最適p H為4。3.不同藍(lán)莓品種的對(duì)4種根腐病病原菌敏感性存在差異選擇6個(gè)供試品種進(jìn)行4株供試菌株接種,比較敏感性差異,并選取4株供試菌均能夠侵染的‘奧尼爾’品種進(jìn)行葉片與枝條的接種,比較供試菌株之間致病力的差異。在不同品種的敏感性差異研究中,接種30 d時(shí),菌株HNCS02Bb對(duì)供試品種‘埃利奧特’與‘夏普藍(lán)’未表現(xiàn)出致病性,HNCS02Da對(duì)全部供試品種有致病性,但是不同品種發(fā)病程度不同,供試菌株SDRS02Ba對(duì)‘埃利奧特’品種未表現(xiàn)致病性,YNQJ01Aa對(duì)‘夏普藍(lán)’品種未表現(xiàn)致病性。菌株YNQJ01Aa除可以侵染藍(lán)莓的根部外,還可侵染葉片與枝條,且發(fā)病迅速,3種鐮孢菌中HNCS02Bb與HNCS02Da除可以侵染藍(lán)莓的根部外也可以侵染藍(lán)莓葉片與枝條,但致病力較弱,只有SDRS02Ba不具備侵染葉片的能力,只能侵染根部和枝條,對(duì)枝條致病性力弱。4.分別設(shè)計(jì)了C.ilicicola與F.equiseti的種特異性引物,集成了前人發(fā)表的F.oxysporum與F.commune種特異性引物本研究鑒定出的4種病原菌中,F.oxysporum與F.commune在PCR檢測(cè)方面,前人的研究有很多,因此,可采用已報(bào)道的引物進(jìn)行檢測(cè)。而C.ilicicola與F.equiseti相關(guān)研究較少,本文針對(duì)這兩個(gè)種進(jìn)行了特異性引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證,C.illicola特異性引物Cail4F/R基于β-tubulin基因設(shè)計(jì),產(chǎn)物片段長(zhǎng)度362 bp,F.equiseti特異性引物Feq EF/R基于EF-1α基因,其產(chǎn)物長(zhǎng)度200 bp。經(jīng)驗(yàn)證,兩對(duì)引物的特異性較好,只能對(duì)目標(biāo)菌擴(kuò)增出條帶,而對(duì)非目標(biāo)的藍(lán)莓根腐病菌種類、藍(lán)莓其他屬的病原菌以及寄主植物藍(lán)莓的總DNA不會(huì)擴(kuò)增出條帶。引物靈敏度測(cè)試結(jié)果顯示,Cail4F/R可以檢測(cè)出25μl體系中100 pg的目標(biāo)真菌DNA,Feq EF/R可以檢測(cè)出25μl體系中1 ng的目標(biāo)真菌DNA。對(duì)于F.oxysporum與F.commune的特異性檢測(cè),本研究應(yīng)用了前人設(shè)計(jì)的引物,最終確定引物C1/C2與FO1/FO2靈敏度與特異性較好。4對(duì)引物相結(jié)合,可實(shí)現(xiàn)對(duì)藍(lán)莓根部病原菌的檢測(cè),其退火溫度相近,可以在同一反應(yīng)條件下擴(kuò)增。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.639
【部分圖文】：
Lombard等(2010)基于ACT.,BT,CAL.,HIS3.,ITS,LSU.以及EF-1
11圖 1-2 Watanabe 等 (2011) 對(duì) Fusarium 屬基于 EF-1α與 RPB2 建立的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1-2 Phylogenetic tree based on EF-1α and RPB2 of the genus Fusarium by Watanabe et al.(2011)
圖 2-1 鐮孢菌根腐病癥狀及 3 株代表菌株菌落形態(tài)腐病原始發(fā)病癥狀；B. 病害標(biāo)本的縱切圖；C. 菌株 HNCS02Bb 在 PDA 上；D. 菌株 HNCS02Da 在 PDA 上 25 °C 條件下培養(yǎng) 7 d 的菌落；E. 菌株 SDRS The symptoms of blueberry root rot caused by Fusarium and characterirepresentitive isolates
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2885226
