發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 19:37

　　 磷酸化是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在植物病毒侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。病毒的復(fù)制酶、運(yùn)動(dòng)蛋白、外殼蛋白和病毒編碼的RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)被磷酸化后都可以調(diào)節(jié)病毒的侵染和致病性。大麥條紋花葉病毒(Barly striosaic virus,BSMV)是一種ss(+)RNA病毒,它編碼的γb蛋白在植物防御和病毒反防御的軍備競(jìng)賽中具有多重功能,但γb蛋白是否存在磷酸化修飾及其對(duì)病毒侵染和寄主響應(yīng)的影響并不清楚。本研究分析了γb蛋白磷酸化的生物學(xué)功能,并對(duì)本生煙激酶STY46通過(guò)與γb蛋白互作負(fù)調(diào)控BSMV侵染的分子機(jī)制進(jìn)行了初步分析。本研究首先利用絲氨酸磷酸化特異抗體(anti-phosphoserine)檢測(cè)到BSMVI γb蛋白在受侵染的植物體內(nèi)存在磷酸化修飾,經(jīng)體外磷酸化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析,證明γb蛋白可以被本生煙中類PKA蛋白激酶磷酸化,Ser-96是其主要的磷酸化位點(diǎn)。γb蛋白非磷酸化突變體病毒(BSMVS96A和BSMVS96R)誘導(dǎo)雙子葉植物和單子葉植物產(chǎn)生細(xì)胞壞死反應(yīng),病株中的病毒積累量減少,而模擬磷酸化突變體病毒BSMVS96D的致病癥狀與野生型病毒一致,說(shuō)明γb的磷酸化狀態(tài)影響了 BSMV的致病性和病毒積累量。γb蛋白非磷酸化突變體S96A的VSR活性顯著減弱,而模擬磷酸化突變體S96D的VSR活性與野生型γb相當(dāng)。γb蛋白的磷酸化狀態(tài)不影響其自身互作和多聚化能力,但磷酸化化后可增強(qiáng)其結(jié)合21 nt siRNA的能力。這些結(jié)果表明,γb蛋白被PKA磷酸化是其發(fā)揮VSR活性進(jìn)而抑制寄主RNA沉默所必需的。除抑制植物RNA沉默外,γb蛋白被PKA磷酸化還能夠抑制寄主的細(xì)胞壞死反應(yīng)。利用瞬時(shí)表達(dá)、轉(zhuǎn)基因植株組成型表達(dá)和通過(guò)γb缺陷型病毒(BSMV△γb)侵染表達(dá)等實(shí)驗(yàn),證明來(lái)源于其它病毒的RNA沉默抑制子均不能抑制BSMVS96A引起的細(xì)胞壞死反應(yīng),只有回補(bǔ)正常功能的Yb蛋白才能有抑制作用。證明磷酸化的γb蛋白對(duì)植物細(xì)胞壞死反應(yīng)的抑制獨(dú)立于其VSR活性,這兩種抑制作用在功能上是相互獨(dú)立的。因此,γb在Ser-96被PKA磷酸化對(duì)于維持病毒持續(xù)侵染和寄主適度反應(yīng)的平衡至關(guān)重要。除此之外,還發(fā)現(xiàn)BSMV yb蛋白與本生煙激酶NbSTY46在體內(nèi)和體外直接互作,γb的BM結(jié)構(gòu)域(aa 19-47)和STY46激酶家族的保守氨基酸Thr-436分別是互作的關(guān)鍵區(qū)和關(guān)鍵氨基酸。NbSTY46的Thr-436突變?yōu)锳(T436A)后,不僅其自磷酸化活性喪失,而且既不能與γb互作也不能將γb磷酸化。BSMV侵染不影響NbSTY46表達(dá)水平,也不改變其亞細(xì)胞定位。瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)基因組成型超表達(dá)NbSYT46激酶均抑制病毒的侵染和復(fù)制,而通過(guò)轉(zhuǎn)基因下調(diào)本生煙NbSYT46的表達(dá)可加重BSMV的癥狀,增加病毒積累量,且NbSTY46對(duì)病毒侵染的負(fù)調(diào)節(jié)依賴其激酶活性。超表達(dá)NbSTY46不影響γb的VSR活性,但競(jìng)爭(zhēng)性BiFC的初步結(jié)果暗示NbSTY46有可能抑制γb蛋白與復(fù)制酶αa的互作。上述研究結(jié)果表明,自磷酸化的本生煙激酶NbSYT46通過(guò)與γb直接互作并將其磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)BSMV的復(fù)制,進(jìn)而抑制BSMV的侵染。這些研究結(jié)果為闡明病毒蛋白磷酸化如何平衡病毒的持續(xù)侵染和寄主的適度反應(yīng),以及植物激酶蛋白在病毒與寄主互作中的防御功能提供了新的科學(xué)證據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

圖１－１抗病毒ＲＮＡ沉默通路以及不同ＲＮＡ沉默抑制子發(fā)揮功能的機(jī)制（Ｃｒｏｒｂａｅｔａｌ．，?２０１５）??植物體內(nèi)主要包括兩種水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默ＴＧＳ?（右）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默ＰＴＧＳ?（左）。??其中ＲＮＡ病毒的ＶＳＲ主要抑制ＰＴＧＳ，?ＤＮＡ病毒主要抑制ＴＧＳ。紅色標(biāo)注代表各個(gè)ＶＳＲｓ發(fā)揮功能的機(jī)制。??植物通過(guò)ＲＮＡ沉默途徑來(lái)抵抗病毒的侵染，為了抵抗植物的抗病毒ＲＮＡ沉默，病毒在長(zhǎng)期??進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生一類蛋白，稱之為病毒編碼的ＲＮＡ沉默抑制子（ｖｉｒａｌ?ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ?ｏｆ?ＲＮＡ??ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，?ＶＳＲ）。目前己報(bào)道的ＲＮＡ沉默抑制子有５０多種，幾乎涵蓋了所有的植物病毒屬??２??

圖１－２?ＴＣＶ?ＣＰ－ＨＲＴ介導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng)模型（Ｚｈｕ?ｅｔａｌ．，?２０１４）??ＨＲＴ主要存在于質(zhì)膜上，隨著ＴＣＶ的侵染，ＨＲＴ可以識(shí)別ＣＰ蛋白，此時(shí)可以誘導(dǎo)大部分的ＤＲＢ４重新定位到細(xì)??胞質(zhì)中，與ＣＰ互作。ＫＤＳ１通過(guò)與ＨＲＴ互作增強(qiáng)ＨＲＴ－ＣＰ介導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng)，ＣＲＴ１通過(guò)與ＨＲＴ互作維持其蛋??白穩(wěn)定性，但二者均不與ＴＣＶＣＰ互作，作者推測(cè)ＣＰ介導(dǎo)的ＨＲ反應(yīng)的激活可能與其減弱ＨＲＴ－ＤＲＢ４的互作相關(guān)。??（２）?ＰＶＸ?Ｐ２５蛋白引起的類ＨＲ?（ＨＲ－ｌｉｋｅ）壞死反應(yīng)??ＰＶＸ的基因組由一條正義單鏈ＲＮＡ組成，編碼三聯(lián)體運(yùn)動(dòng)蛋白（ｔｒｉｐｌｅ?ｇｅｎｅ?ｂｌｏｃｋ，?ＴＧＢ）。其??

旋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ｙｂ在體外確實(shí)可以促進(jìn)ａａ將ｄｓＲＮＡ打開(kāi)為ｓｓＲＮＡ，而且當(dāng)丫ｂ喪失結(jié)合ｓｓＲＮＡ的能??力時(shí)，便不能促進(jìn)ａａ的解旋能力（Ｚｈａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２０１７）。通過(guò)以上結(jié)果，Ｚｈａｎｇ等人提出了?ｙｂ參與??ＢＳＭＶ復(fù)制的模型（圖１－４）：??妙?ｉｆ??ｎｄｓＲｉ?／?多、??１ｖ—?丨丨丨ＩＴ＿?丨?１１１（＋）??、?公／ｂ?＾ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ（．）??＾?▲?Ｙｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｙｂ??．?Ｙｂ?／?Ｉ??７?ＴｂＴｂ（＾ｊ丨丨丨ｉｌｌ丨丨丨ＩｉｉＩｉＩｉｉ川丨丨＂Ｉ川丨丨??（＋）ｇＲＮＡ?Ｖ?＼?％ｍｉｎｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉ??Ｃｙ’ｎｄｉｎｇ??Ｔｒａｎｓ．ａｔ．ｃｎ?Ｖ??圖１－４?ＢＳＭＶｙｂ蛋白參與病毒復(fù)制的模型（Ｚｈａｎｇ?ｅｌ?ａｌ．，?２０１７）??在復(fù)制的初始階段，ｃｉａ和ｙａ蛋白從亞基因組翻譯出來(lái)并形成病毒復(fù)制復(fù)合物（ｖｉｒａｌ?ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ，?ＶＲＣ）。ａａ??復(fù)制酶亞基與Ｙａ復(fù)制酶相互作用，定位于葉綠體。ＶＲＣ形成后，復(fù)制酶可以利用親本ｇＲＮＡ作為模板合成負(fù)鏈??ｇＲＮＡ，兩條鏈形成ｄｓＲＮＡ。首先，以ｄｓＲＮＡ為模板合成正鏈ＲＮＡ以利于ａａ和丫ａ復(fù)制酶亞基的翻譯，隨后，合??成負(fù)鏈ＲＮ／＾并且ａａ通過(guò)與７ｂ蛋白互作將其募集至葉綠體，通過(guò)增強(qiáng)ａａ解螺旋酶活性來(lái)促進(jìn)病毒的復(fù)制。??１．１．３?ＶＳＲｓ與宿主蛋白的互作研究??植物通過(guò)抗病毒ＲＮＡ沉默途徑來(lái)防御病毒的侵染，病毒為了成功的侵染植物進(jìn)化出ＲＮＡ沉??默抑制子
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