發(fā)布時間：2020-11-17 18:59

　　 微孢子蟲(Microsporidia)是一類細胞內專性寄生的真核生物,在自然界具有廣泛的宿主域,數目眾多、分布廣泛。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis,Nb)是微孢子蟲屬的典型種,它能夠引發(fā)家蠶微粒子病(Pebrine)。該病即可食下傳染,也可由帶病母蛾胚種傳染,是蠶業(yè)生產上的毀滅性病害,因此被所有蠶業(yè)生產國列為法定檢疫對象。除通過母蛾鏡檢淘汰帶毒蠶種外,目前家蠶微粒子病的防治方法還包括化學防治和物理防治兩大類�；瘜W防治方法包括化學藥物消毒和化學藥物治療。消毒藥物一般具有強腐蝕性,而且對帶毒蠶卵中的病原體沒有防治效果;治療藥物長期服用對蠶體有一定毒性,影響蠶種質量。已報道的物理防治法主要有溫湯浴種法、高溫即時浸酸法(高溫即浸法)及干熱空氣處理法。高溫即浸法效果明顯,操作簡單,但之前高溫即浸試驗以多化性家蠶品種開展的研究,針對二化性蠶品種的高溫即浸法條件尚未建立,防治效果有待驗證。本研究通過養(yǎng)蠶試驗明確了高溫高溫即浸法對家蠶微粒子病的防治效果,采用吉姆薩染色法觀察了蠶種即浸適期病原在蠶卵中的發(fā)育形態(tài),利用熒光定量PCR技術檢測了高溫即浸處理對蠶卵中家蠶微孢子蟲的滅活效果,通過高通量測序分析了高溫即浸處理后家蠶胚胎和病原的基因表達變化,闡明了高溫即浸防治家蠶微粒子病胚種傳染的機理,為生產上應用高溫即浸防治家蠶微粒子病提供科學依據。取得以下研究成果:⒈對家蠶二化性四元雜交品種兩廣二號的帶毒蠶卵進行高溫即浸處理,蠶卵孵化后分別飼養(yǎng)至3齡眠蠶和5齡起蠶用顯微鏡鏡檢Nb,發(fā)現與常規(guī)即浸處理相比,帶毒蠶卵經高溫即浸處理后家蠶微孢子蟲感染率分別為3.55±1.55%和13.10±5.90%,相對防治效果分別是92.30±2.95%和81.80±0.06%。由此可見,高溫即浸處理能夠有效阻斷家蠶微粒子病的胚種垂直傳播,對家蠶微粒子病有顯著的治療效果。2.通過吉姆薩染色法對高溫浸酸時期(卵齡18~22 h)帶毒蠶卵中家蠶微孢子蟲的發(fā)育狀態(tài)進行觀察,發(fā)現帶毒蠶卵中的病原為雙核、四核裂殖體。浸酸處理48 h后,陽性對照組和常規(guī)即浸處理組蠶卵中均仍觀察到裂殖體,高溫處理組則沒有發(fā)現病原,推測高溫即浸處理的作用有效靶點為家蠶微孢子蟲的裂殖體階段。3.利用熒光定量PCR技術建立了以家蠶微管蛋白Tubulin為靶基因的標準曲線,對卵齡24~240 h陽性對照、常規(guī)即浸組和高溫即浸組內帶毒蠶卵中微孢子蟲進行絕對定量分析。結果發(fā)現:常規(guī)或高溫即浸處理后每日取樣蠶卵中家蠶微孢子蟲的檢測值均顯著降低,高溫即浸組明顯低于常規(guī)即浸處理,表明兩種浸酸處理對蠶卵中的家蠶微孢子蟲均有滅活作用,但是高溫處理的滅活效果更為顯著。根據即浸處理后帶毒蠶卵內病原量的變化規(guī)律,推測高溫即浸處理能夠滅活蠶卵內的病原裂殖體,少量未被滅活的成熟孢子則能夠繼續(xù)生長發(fā)育。4.對帶毒蠶卵分別進行常規(guī)即浸處理和高溫即浸處理,利用RNA-Seq技術對陽性對照組、常規(guī)處理組和高溫處理組的蠶卵樣本進行高通量測序,并對處理前后的差異表達基因(DEGs)進行GO功能分析和KEGG pathway分析。結果發(fā)現,常規(guī)處理后家蠶差異表達基因400個,病原差異表達基因38個,高溫處理組后家蠶差異表達基因1999個,病原差異表達基因20個。高溫即浸處理后家蠶熱激蛋白等基因表達顯著上調,病原差異表達基因數量較常規(guī)處理組明顯降低,推測高溫即浸處理能夠激發(fā)蠶卵免疫應答增強對病原的抗性,同時影響家蠶微孢子蟲的基礎代謝導致病原裂殖體死亡。
【學位單位】：重慶師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S884.21
【部分圖文】：

圖 1.1 家蠶微孢子蟲的超微結構[20]。Fig1.1 Ultrastructure of Nb的微孢子蟲被蟻蠶或幼蟲誤食后進入蠶的消化道后，器和孢子形成期 3 個階段后，完成一個世代，這一過程

蟲生活史示意圖[21-22]。L.中腸腸腔；MV 微絨毛肉細胞；H.血細胞；a.長極絲孢子；b.發(fā)芽中的長殖體；g.母孢子；h.孢子母細胞；n.長極絲孢子母孢子；j.短極絲孢子；k.發(fā)芽中的短極絲孢子；m.

在卵齡分別為 18、20、22h的陽性對照與陰性對照蠶卵樣本中，陽性對照組均觀察到微孢子蟲的裂殖體，有雙核、四核裂殖體形態(tài)（黑色箭頭所指），表明沒有經過處理的帶毒蠶卵中微孢子蟲的增殖活動旺盛（圖3.1），紅色箭頭所指為家蠶宿主細胞核結構。圖 3.1 不同卵齡蠶卵中家蠶微孢子蟲發(fā)育觀察。A 陽性對照組，B 陰性對照組。Fig 3.1 The development observation of Nb in silkworm eggs of different age. A positive control, Bnegative control.3.2.3 作用靶點的驗證卵齡 20h時分別進行常規(guī)和高溫即浸處理，對浸酸處理后 48h的蠶卵進行觀察，發(fā)現在常規(guī)即浸處理中也可發(fā)現少量病原裂殖體，同期經過高溫即浸處理后的蠶卵未發(fā)現病原（圖3.2），表明高溫即浸處理對微孢子蟲的裂殖體有較好的滅活效果。
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本文編號：2887811