發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 13:56

　　 菜青蟲(Pieris rapae)屬鱗翅目粉蝶科,嗜食十字花科的白菜、甘藍(lán)、油菜、蘿卜、花椰菜等蔬菜,是危害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲之一。中腸作為昆蟲消化器官的主要部位,能分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多種消化酶參與消化食物,而營養(yǎng)物質(zhì)吸收是機(jī)體進(jìn)行其他生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此,若我們了解菜青蟲食物消化機(jī)制,找到其中的關(guān)鍵消化酶,就能通過阻斷其物質(zhì)吸收來控制蟲害。本文利用高通量測序技術(shù)、分子生物學(xué)等方法研究菜青蟲受饑餓脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄譜變化,并挖掘消化相關(guān)基因;同時(shí)選取2個(gè)絲氨酸蛋白酶候選基因進(jìn)行克隆、組織表達(dá)和異源表達(dá)研究。這些研究為進(jìn)一步探索菜青蟲食物消化吸收機(jī)制和可能抗蟲靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.對(duì)菜青蟲正常和饑餓兩種狀態(tài)中腸樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得的17.82Gb的數(shù)據(jù),51544條Unigene。經(jīng)NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫同源注釋發(fā)現(xiàn),共有22233條Unigene獲得注釋信息。對(duì)比兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組,共獲得2682個(gè)差異表達(dá)基因,其中有1610個(gè)基因下調(diào),1072個(gè)基因上調(diào),有56個(gè)是高表達(dá)的差異表達(dá)基因。將差異表達(dá)基因經(jīng)NR、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫功能注釋發(fā)現(xiàn),在菜青蟲受到饑餓脅迫時(shí),其物質(zhì)代謝活動(dòng)、能量代謝活動(dòng)、酶合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等受到明顯影響。2.基于中腸作為菜青蟲食物消化的主要場所,選擇對(duì)其表達(dá)的消化相關(guān)基因進(jìn)行挖掘,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菜青蟲中腸中表達(dá)了80個(gè)絲氨酸蛋白酶,10個(gè)淀粉酶,42個(gè)脂肪酶,34個(gè)羧肽酶,未發(fā)現(xiàn)纖維素酶,其食物中纖維素可能依靠菜青蟲腸道菌進(jìn)行消化。其中,在菜青蟲受到饑餓脅迫時(shí),差異表達(dá)的淀粉酶和羧肽酶全部下調(diào),而絲氨酸蛋白酶和脂肪酶大部分下調(diào),少部分上調(diào),可能是為了減小體內(nèi)的能量消耗且保持機(jī)體基本活動(dòng),對(duì)食物消化相關(guān)基因進(jìn)行了調(diào)控。3.對(duì)菜青蟲中腸轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性進(jìn)行分析,為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菜青蟲中腸密碼子使用整體偏好性程度不高,但不同基因之間存在明顯密碼子使用偏好性;菜青蟲中腸表達(dá)基因偏好以A/U結(jié)尾的密碼子,GAA,UUU,AAU,UAU 4個(gè)密碼子為其最優(yōu)密碼子;菜青蟲中腸表達(dá)的絲氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)在6種不同宿主中表達(dá)難度從大到小分別為:大腸桿菌B昆蟲High5細(xì)胞/哺乳動(dòng)物HEK293S細(xì)胞煙草/畢赤酵母/擬南芥。4.克隆了一個(gè)胰凝乳蛋白酶基因PrCT1,該基因編碼區(qū)由861核苷酸組成,編碼286個(gè)氨基酸,含有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體(H_(57),D_(102)與S_(195)),經(jīng)絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋的分析顯示屬于胰凝乳蛋白酶。它與黑脈金斑蝶(GenBank登錄號(hào):OWR53227)胰凝乳蛋白酶的同源性最高,達(dá)到49%,且親緣關(guān)系最近。利用qRT-PCR檢測PrCT1基因在菜青蟲中轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn),它主要在菜青蟲中腸表達(dá),且饑餓與決明胰蛋白酶抑制劑喂食處理后表達(dá)水平均下調(diào),推測其可能是菜青蟲中腸中發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗蟲靶點(diǎn)。將PrCT1基因插入到原核表達(dá)載體pET28a,轉(zhuǎn)化Rosseta(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)發(fā)現(xiàn),PrCT1重組蛋白以包涵體形式表達(dá);將PrCT1基因插入到真核表達(dá)載體pPIC9K,轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行真核表達(dá)發(fā)現(xiàn),PrCT1基因能在畢赤酵母中轉(zhuǎn)錄,但僅在胞內(nèi)檢測到非常低的目的蛋白表達(dá)。5.克隆了一個(gè)胰蛋白酶基因PrT1,該基因編碼區(qū)由1206核苷酸組成,編碼401個(gè)氨基酸,含有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體(H_(57),D_(102)與S_(195)),經(jīng)絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋的分析顯示屬于胰蛋白酶。它與臍橙螟(GenBank登錄號(hào):XP_013191840)和蠟螟(GenBank登錄號(hào):AXY94763)絲氨酸蛋白酶同源性最高,分別為61.32%、59.19%,且親緣關(guān)系最近。將PrT1基因插入到原核表達(dá)載體pET28a,轉(zhuǎn)化Rosseta(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)發(fā)現(xiàn),PrT1重組蛋白也以包涵體形式表達(dá)。再將PrT1重組蛋白皮下注射新西蘭兔制備多克隆抗體,經(jīng)Western Blot檢測抗體特異性較好。利用qRT-PCR和Western Blot檢測PrT1在菜青蟲不同組織部位表達(dá)發(fā)現(xiàn),qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果基本一致,PrT1主要在菜青蟲中腸表達(dá),其他部位(頭、尾、脂肪體)表達(dá)量非常低,同時(shí)在菜青蟲受到饑餓脅迫時(shí),PrT1在菜青蟲中腸表達(dá)水平顯著升高。因此,我們推測胰蛋白酶PrT1可能在菜青蟲中腸參與食物消化,但其具體功能還需后續(xù)進(jìn)一步研究才能了解。
【學(xué)位單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S433.4
【部分圖文】：

度：樣品濃度在250μg/μL以上，且總量大于30μg；整性：28S與18S亮度比大于等于1.5，且無拖尾現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄組測序百邁克生物科技有限公司確認(rèn) RNA 樣品合格后，采用 Illumina HiSe量測序平臺(tái)對(duì)菜青蟲兩個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組序列組裝當(dāng)時(shí)沒有菜青蟲基因組，經(jīng)質(zhì)量過濾的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)采用 Trinity 軟因組的從頭合并組裝（de novo assembly）。Trinity 軟件首先將 Readser 打斷來成小片段，然后選擇頻率最高的 K-mer 作為種子向兩端進(jìn)行tig，再利用 Contig 聚簇得到 Component，并構(gòu)建 De Bruijn 圖，最后ead 解開 De Bruijn 圖，獲得轉(zhuǎn)錄本序列（圖 2-1）。組裝完整后評(píng)估轉(zhuǎn)確保后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可靠。

圖 2-2 菜青蟲中腸 RNA 瓊脂電泳序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果0 高通量測序技術(shù)對(duì)菜青蟲正常和饑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 17.82Gb，每個(gè)樣品 Q20續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，將轉(zhuǎn)錄組測序錄組分別獲得 28,918,396 和 30,791,6表 2-2 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表正常 28,918,396 19,807,564 68.49% 93.14% 47.48%

圖 2-3 組裝 Unigene 長度分布4 轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋 Unigene 序列比對(duì)到 NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG 數(shù)據(jù)233 條 Unigene 獲得注釋信息。其中 NR 數(shù)據(jù)庫共注釋 18814 條 Unigen與黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）（6665，35.50%）和家蠶（Bombyx4，24.42%）有最大同源性；GO 數(shù)據(jù)庫共注釋 10725 條 Unigene，其中大類別分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)數(shù)目分別為 13635（23.50%）、1744%）、27320（47.0%），而細(xì)胞組分中注釋最多的前 3個(gè)分別為細(xì)胞（cell）（%）、細(xì)胞組分（cell part）（3539，33.00%）、細(xì)胞器（2513，23.43%），釋最多前 3 個(gè)是催化活性（catalytic activity）（5536，51.62%）、結(jié)合（b4，49.55%）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）(802,7.48%)，生物學(xué)過程 3 個(gè)是代謝過程（metabolic process（）6686，62.34%）、細(xì)胞過程（cellular
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