發(fā)布時間：2020-11-20 22:36

　　 引起小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)的主要病原菌為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearwm,F.g)。作為一種世界性的麥類病害,每年都給小麥生產(chǎn)帶來較大的損失。禾谷鐮刀菌在侵染小麥的過程中不僅造成產(chǎn)量損失,而且產(chǎn)生如脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)等真菌毒素,影響小麥的品質及商品價值,嚴重危害人、畜健康。網(wǎng)格蛋白介導的內吞是細胞內外信號傳導以及物質運輸?shù)闹饕�方�?在生物體的生長發(fā)育過程中起到非常重要的作用。近年來,對植物網(wǎng)格蛋白的研究逐漸增多,發(fā)現(xiàn)植物網(wǎng)格蛋白能調控膜運輸、鹽脅迫、根瘤的形成、生長素信號及下胚軸的形成等,但是植物網(wǎng)格蛋白在抗真菌病害方面的研究較少,具體功能不清楚。實驗室前期對感病材料濟麥22(JM22)以及抗病材料濟麥22-Fhb7(JM22-Fhb7)接種禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearwm,F.g),進行轉錄組測序和生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白等內吞途徑相關基因的表達在接種前后差異較大,表明網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑與赤霉病的發(fā)生很可能有密切關系。本研究,從濟麥22-Fhb7中克隆得到了網(wǎng)格輕鏈蛋白基因TaCLC1(GenBank No:KT345966),并且對其進行了功能分析。主要結果與結論如下:(1)利用同源克隆和生物信息學方法克隆獲得TaCLC1基因的全長cDNA序列(GenBank:KT345966)。該基因全長1207 bp,包含一個936 bp開放閱讀框,編碼311個氨基酸,分子量約32.9KDa。TaCLC1為單拷貝基因,位于小麥7BL染色體上;而且TaCLC1與大麥、玉米以及高粱中的網(wǎng)格輕鏈蛋白同源性較高。將TaCLC1::GFP融合蛋白在煙草表皮細胞中瞬時表達,利用雙光子顯微鏡觀察到,該融合蛋白定位于細胞質與細胞膜中。(2)qRT-PCR結果表明,TaCLC1在根、莖、葉和穗部均有表達,并且在葉片中的表達量最高;同時該基因的轉錄受到水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等多種激素及禾谷鐮刀菌的誘導表達。(3)利用大麥條紋花葉病毒(Barely Stripe Mosaic Virus,BSMV)介導的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技術,在小麥葉部進行了赤霉病的抗性鑒定,結果顯示,BSMV::TaCLC1植株中腐生斑的面積明顯比對照植株和BSMV::00植株中腐生斑面積大,同時禾谷鐮刀菌的相對數(shù)量也較多,說明TaCLC1在小麥中能夠抑制赤霉菌的生長。(4)利用轉基因技術獲得煙草以及擬南芥TaCLC1過表達株系。將禾谷鐮刀菌接種到野生型擬南芥和過表達TaCLC1基因擬南芥的葉片上,5d后,統(tǒng)計各個株系的發(fā)病情況發(fā)現(xiàn),野生型擬南芥葉片病斑面積小于25%的葉片數(shù)量占總數(shù)的18%,轉基因擬南芥葉片上病斑面積小于25%的葉片占75%,轉基因株系中大于75%的葉片數(shù)量占20%;同時發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥中禾谷鐮刀菌的相對數(shù)量為轉基因的2倍左右。將禾谷鐮刀菌接種到野生型煙草與轉基因煙草的葉片上,發(fā)現(xiàn)野生型煙草葉片上有明顯的較大病斑,而轉基因煙草葉片上僅有個別的輕微病斑,且病原菌在轉基因煙草葉片中菌絲的生長量要明顯少于野生型煙草。上述結果說明,TaCLC1在調控小麥抗赤霉病中發(fā)揮著重要的功能。(5)檢測TaCLC1基因的沉默小麥植株中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)合成關鍵基因TaPAL、TaOPR的表達量發(fā)現(xiàn),與對照相比,接種禾谷鐮刀菌后沉默株系中TaPAL、TaOPR的表達量上調程度低于野生型。檢測轉基因煙草和擬南芥中病程相關蛋白基因的轉錄水平,發(fā)現(xiàn)過表達TaCLC1植株中PR1、PR2和PR3、PR5的轉錄水平明顯高于WT。上述結果表明,TaCLC1有可能通過促進病程相關蛋白基因的表達抵御病原菌侵染。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S435.121.45
【部分圖文】：

圖 3-4 TaCLC1-GFP 融合蛋白在煙草表皮中的亞細胞定位Fig. 3-4 Subcellular localization of TaCLC1-GFP fusion protein in tobacco epidermis1 基因的表達模式分析1 基因在禾谷鐮刀菌處理條件下的表達模式分析一心期小麥幼苗，對小麥幼苗的心葉進行注射禾谷鐮刀菌的游動孢子3h，6h，12h，24h，36h 和 48h 取接種葉片，提取 RNA，反轉錄成物 qTaCLC1-5/3，用 qRT-PCR 檢測 TaCLC1 基因轉錄水平，發(fā)現(xiàn)，與谷鐮刀菌 1h 后，TaCLC1 基因的轉錄水平開始上升，到 6h 達到高之后又繼續(xù)上升至 36h 到達頂峰，48h 又回落（圖 3-5）。在 0-6h 內 MOCK（用于回溶禾谷鐮刀菌游動孢子的無菌水）處理的情況下，水平都出現(xiàn)上升的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有可能為目的基因受損禾谷鐮刀菌處理 24h 后，TaCLC1 基因的表達重新上調，可能是由于

圖 3-5 小麥 TaCLC1 基因對禾谷鐮刀菌的響應表達分析Fig. 3-5 Response Analysis of Wheat TaCLC1 Gene to Fusarium graminearum1 基因在不同植物激素誘導處理條件下的表達模式分析JA 途徑在植物抗病信號轉導通路中起著重要的調控作用，并且已SA、MeJA 能夠提高小麥對赤霉病的抗性。為了明確 TaCLC1 是否，我們取一葉一心期小麥，分別進行噴施 2mM/L SA、0.5 mM/L Me24h，36h 和 48h 取心葉葉片，每個時間點取三棵植株，用 qRT-P的轉錄水平。發(fā)現(xiàn)，在噴施 SA 12h 后，TaCLC1 基因的轉錄水平開，之后又回落，呈現(xiàn)拋物線特征（圖 3-6A）。而噴施 MeJA 后， 24h 達到高峰，之后又回落，同樣呈現(xiàn)拋物線特征（圖 3-6B），說明 SA、MeJA 處理的誘導表達。 B

圖 3-7 TaCLC1 基因在小麥中組織特異性表達分析Fig. 3-7 Tissue-specific expression analysis of TaCLC1 gene in wheS 沉默小麥 TaCLC1 后抗赤霉病分析連接原理，設計特異性接頭引物，擴增目的基因片的基因與 γ 載體，將酶切處理后的目的基因及線taclc1 已經(jīng)成功連接（圖 3-8）。將 α、β、γ/γ-tac含有 α、β 和 γ 組分的農(nóng)桿菌液按照 1:1:1 的比例混煙展開葉，進行病毒的擴繁，9d 后提取上部葉片測證明病毒在本生煙中擴繁成功（圖 3-9）。利用大技術（BSMV-VIGS）對 TaCLC1 進行基因沉默（汁液摩擦接種一葉一心期小麥葉片，用含有 α、β為 BSMV::00，用 α、β 和 γ-taclc1 病毒汁液摩擦18d 后檢測接種葉片上部第一片葉的轉錄水平。經(jīng)
【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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本文編號：2892096