發(fā)布時間：2020-11-18 23:57

　　 隨著我國楊樹種植面積的逐年增加,以及在楊樹造林過程中林木撫育、管理、保護(hù)、防治不當(dāng)?shù)仍��?楊樹病蟲害的發(fā)生日趨嚴(yán)重,同時阻礙了我國林業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展。我國楊樹病蟲害的綜合治理仍以化學(xué)防治為主導(dǎo),然而化學(xué)農(nóng)藥的長期使用不但防治效果變差,而且給自然環(huán)境造成一定的污染和殘留。因此,利用微生物代替化學(xué)農(nóng)藥來防治植物病蟲害越來越受林業(yè)保護(hù)工作者的青睞。植物內(nèi)生細(xì)菌定殖于健康植物體內(nèi),與寄主植物在長期進(jìn)化過程中形成和諧聯(lián)合關(guān)系,并對寄主植物具有抗病、促生、固氮和生物修復(fù)等生防潛力,是潛在的天然生物防治資源。此外,內(nèi)生細(xì)菌還可作為外源基因的良好載體,通過基因工程技術(shù)將外源抗病、殺蟲基因?qū)�入�?nèi)生細(xì)菌中,提高植物抗病蟲害等能力的同時不改變植物自身的基因組。因此,利用植物有益內(nèi)生細(xì)菌及其工程菌株促進(jìn)植物生長,并提高植物的抗病蟲害能力已成為植物病蟲害生物防治的研究熱點。課題組前期從楊樹干部分離到一株楊樹內(nèi)生細(xì)菌吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007,該菌株不僅能促進(jìn)楊樹生長,還對楊樹潰瘍病具有一定防治效果,是一株安全的楊樹潰瘍病生防菌株。洋蔥伯克氏菌群Burkholderia cepacia complex(Bcc)的許多菌株對多種植物病原真菌具有拮抗作用,并已被廣泛應(yīng)用與植物病害的生物防治,但目前國內(nèi)外有關(guān)Bcc工程菌構(gòu)建的報道尚不多見。本研究以B.pyrrocinia JK-SH007菌株為研究對象,分別將外源抗病、殺蟲基因?qū)�入JK-SH007中,構(gòu)建具有促生、抗病、抗蟲多重生防能力的高效生防工程菌。同時,對工程菌株JK-SH007E1在楊樹根際產(chǎn)生的微生態(tài)效應(yīng)進(jìn)行研究,初步評估工程菌株釋放到環(huán)境后的生物安全性。根據(jù)同源重組原理,分別將枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因Chi113、蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白基因cry218、蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip3A和松材線蟲的幾丁質(zhì)酶基因Bxchi插入到pHKT2載體上的啟動子與gfp報告基因之間,成功構(gòu)建了四個重組質(zhì)粒pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi。質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性試驗表明,除重組質(zhì)粒pHKT2-Bxchi外,其余三個重組質(zhì)粒均有較高的遺傳穩(wěn)定性,其中重組質(zhì)粒pHKT2-Chi113的遺傳穩(wěn)定性最高。利用熱激法將pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi四個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化JK-SH007感受態(tài)細(xì)胞,獲得了四株工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4。這四株工程菌在熒光顯微鏡下均觀察到較強的綠色熒光信號,并且四個外源基因在mRNA水平均得到過表達(dá),而在蛋白水平只有工程菌JK-SH007E1檢測到外源基因的表達(dá)。與野生型菌株JK-SH007相比,工程菌JK-SH007E1產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性及其對楊樹潰瘍病菌的抑菌活性和拮抗能力均得到顯著提高。通過對工程菌JK-SH007E1在楊樹體內(nèi)的定殖規(guī)律研究,發(fā)現(xiàn)工程菌JK-SH007E1能夠以較快的速度進(jìn)入楊樹體內(nèi),并能在楊樹體內(nèi)長期穩(wěn)定地定殖。GFP標(biāo)記法觀察工程菌JK-SH007E1在楊樹無菌苗體內(nèi)的定殖,發(fā)現(xiàn)JK-SH007E1在楊樹組織細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙均有分布。此外,工程菌JK-SH007E1的引入明顯增強了楊樹的光合作用能力和加快了楊樹的生長速度。對工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4的生長特性進(jìn)行研究,并與野生菌JK-SH007進(jìn)行比較,結(jié)果表明外源基因的導(dǎo)入并未影響原有的菌落特征及細(xì)胞形態(tài),但外源重組質(zhì)粒的導(dǎo)入在一定程度上減緩了宿主菌的生長速度。作為轉(zhuǎn)基因微生物,工程菌JK-SH007E1釋放到自然環(huán)境中前,必須對其生物安全性進(jìn)行充分評估。本研究同時利用生物化學(xué)法、Biolog生態(tài)板法和16S rRNA高通量測序技術(shù),充分評估工程菌JK-SH007E1的引入對楊樹根際土壤產(chǎn)生的微生態(tài)效應(yīng)。通過測定楊樹根際四種主要土壤酶活性,發(fā)現(xiàn)工程菌JK-SH007E1的引入增強了楊樹根際的土壤酶活性,尤其是對土壤脫氫酶活性的促進(jìn)作用尤為顯著;同時提高了土壤的肥力,從而促進(jìn)楊樹生長。Biolog生態(tài)板分析結(jié)果表明,工程菌JK-SH007E1在一定程度上提高了楊樹根際土壤微生物的整體活性,豐富了土壤微生物種群及其功能多樣性,但隨著接種時間的延長促進(jìn)作用逐漸減弱。16S rRNA高通量測序結(jié)果表明工程菌JK-SH007E1的引入會引起楊樹根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,但該影響會隨接種時間的延長而變?nèi)酢Ｒ陨涎芯拷Y(jié)果均表明,從長期來看工程菌JK-SH007E1的應(yīng)用對楊樹根際微生物多樣性和種群結(jié)構(gòu)不構(gòu)成潛在威脅或威脅較小。因此,將工程菌JK-SH007E1釋放到環(huán)境中是安全可行的。該研究為楊樹潰瘍病生物防治提供了高效生防菌株,并為今后工程菌JK-SH007E1的安全應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S763.7
【部分圖文】：

圖 2-1 PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測（a，M：500 bp ladder DNAmaker（由上到下依次為 5000 bp、4500 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、500 bp）；泳道 1，2，3，4 分別為含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi基因的大腸桿菌陽性克隆；b，M：1000 bp ladder DNAmaker（由上到下依次為 10000 bp、9000 bp、8000bp、7000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3000 bp、2000 bp、1000 bp）；泳道 1，2，3，4 分別為含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi 的重組質(zhì)粒的 HindⅢ和 KpnⅠ雙酶切驗證；c，M：500 bp ladder DNA maker；泳道 1，2，3，4 分別為含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi 的 JK-SH007 轉(zhuǎn)化子的外源基因檢測）Fig. 2-1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR amplified products(a, M: 500 bp ladder DNA maker (molecular weight of each band from up to down was as follows: 5000 bp,4500 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 500 bp); Lane 1, 2, 3, 4 werepositive clones that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively. b, M: 1000 bp ladder DNA maker(molecular weight of each band from up to down was as follows: 10000 bp, 9000 bp, 8000 bp, 7000 bp, 6000bp, 5000 bp, 4000 bp, 3000 bp, 2000 bp, 1000 bp); Lane 1, 2, 3, 4 were Hind III and Kpn I double digestion ofrecombinant plasmids that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively. c, M: 500 bp ladder DNA maker;Lane 1, 2, 3, 4 were the foreign genes detection of JK-SH007 transformants that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively)

33圖 2-2 pHKT2 質(zhì)粒（a）及四個重組質(zhì)粒（b，c，d，e）的圖譜（用軟件 WinPlas version 2.7 繪制）Fig. 2-2 Maps of plasmid pHKT2 (a) and the four recombinant plasmids (b, c, d, e)(Drawn by WinPlas version 2.7)

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 B. pyrrocinia JK-SH007 感受態(tài)細(xì)胞及陽性克隆的篩選2.2.1 JK-SH007 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察利用熱激轉(zhuǎn)化法將上述構(gòu)建的四個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 JK-SH007 感受態(tài)細(xì)胞，在 Tp 抗性平板上對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。JK-SH007 菌株在熒光顯微鏡下是沒有綠色熒光背景的而pHKT2載體上含有g(shù)fp基因，含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光因此可根據(jù)轉(zhuǎn)化子的綠色熒光發(fā)生情況對 JK-SH007 陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選。從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取單菌落，制成玻片后在 Zeiss 熒光顯微鏡下觀察，將發(fā)綠色熒光的 JK-SH00轉(zhuǎn)化子初步作為陽性克隆。如圖 2-3 所示，在熒光顯微鏡下 JK-SH007 細(xì)胞觀察不到綠色熒光信號，而含有外源重組質(zhì)粒的工程菌 JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3 和JK-SH007E4 均能觀察到明亮的綠色熒光信號，初步證明重組質(zhì)粒 pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A 和 pHKT2-Bxchi 已成功導(dǎo)入 JK-SH007 中。
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本文編號：2889392