發(fā)布時(shí)間：2020-06-24 17:36

【摘要】：鹽脅迫對(duì)水稻等重要作物的生長產(chǎn)生了不利影響,是世界糧食生產(chǎn)的重要障礙之一。培育耐鹽性較強(qiáng)的水稻品種是克服鹽脅迫挑戰(zhàn)的重要途徑。最近發(fā)現(xiàn)SST和HST1這兩個(gè)基因控制水稻耐鹽性,且功能喪失突變體表現(xiàn)為耐鹽性。盡管這兩個(gè)基因已經(jīng)被克隆,但他們?cè)谏�理和生化水平上的耐鹽機(jī)制尚未得到充分的揭示。因此,本研究對(duì)sst和hst1這兩個(gè)突變體進(jìn)行生理和生化分析。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從秈稻品種R401中獲得了ss 突變體。為了獲得hst1突變體,我們利用CRISPR/Cas9方法敲除R401中的HST1基因。利用來自R401的sst和hst1突變體,以R401為對(duì)照,比較了在正常和150mM NaCl脅迫下的一系列性狀,包括營養(yǎng)生長(生長率和生物量)、光合特性、離子含量、有機(jī)溶質(zhì)、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞電解質(zhì)滲漏、葉片水分和抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。對(duì)于營養(yǎng)生長,以根長、莖(地上部)長、葉長、綠葉數(shù)、根和莖的鮮重和干重為指標(biāo)。根據(jù)相對(duì)含水量(RWC)評(píng)估葉片保水情況。用葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量評(píng)價(jià)光合特性。從電解質(zhì)滲漏(EL)的角度來評(píng)估植物細(xì)胞膜的狀態(tài)。脂質(zhì)過氧化用丙二醛(MDA)測定。用脯氨酸含量分析有機(jī)滲透壓物質(zhì)。測定鉀(K+)和鈉(Na+)含量及其比值。采用qRT-PCR系統(tǒng)對(duì)抗氧化生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析,包括超氧化物歧化酶A和B(OsSOD 和OsSODB)、抗壞血酸過氧化物酶1和2(OsAPX1和OPAPX2)、過氧化氫酶B和C(OsCAT 和OsCatC)的基因。主要結(jié)果如下:(1)HST1基因編輯結(jié)果表明,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的60株(T0)幼苗,潮霉素檢測陽性的有58株(96.7%)。測序結(jié)果表明,58個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中有47株(81%)在靶標(biāo)基因有核苷酸插入/缺失。獲得的突變體中12株為純合體,35株為雜合體。(2)在鹽脅迫條件下,所有植株的生長速度和生物量都有所下降。但野生型的下降程度要大于突變體hst1和sst。在正常條件下突變體sst比hst1表現(xiàn)出稍好的生長速率和生物量,而在鹽脅迫下則沒有。在正常條件下,水稻突變體比野生型的生長速率和生物量均有提高(p0.05),但差異不是很大。(3)在正常條件下,所有材料的RWC是相似的,但在鹽脅迫條件下突變體都好于野生型(p0.05)。在正常條件下,sst和hst1的葉綠素a含量與野生型一致,但在鹽脅迫下,葉綠素a、b和總含量高于野生型(p0.05)。葉綠素b的含量低于葉綠素a的含量。(4)鹽脅迫條件下電解質(zhì)滲漏(EL)和脂質(zhì)過氧化(MDA)和脯氨酸明顯增加,但突變體sst和hst1顯著低于野生型(p0.05)。在無鹽條件下,各基因型間差異不大(p0.05)。(5)鹽脅迫條件下突變體的K+/Na+比值比野生型高,hst1的耐鹽指數(shù)最高,為0.706;其次是sst,為0.354;最后為野生型,為0.154。在鹽脅迫條件下,抗氧化基因OsAPX1、OsAPX2和OsSODA在hst1和sst中的表達(dá)量顯著高于野生型(p0.05)。與對(duì)照相比,鹽脅迫后OsODB和OsCATB在sst中表達(dá)水平增加,而在hst1和野生型中卻沒有增加。然而OsCATC轉(zhuǎn)錄水平在hst1中顯著升高,而在sst和野生型中則無明顯增加(p0.05)。35天齡的植株用不同濃度的鹽處理36小時(shí)后,在中度鹽(150 mM)脅迫下,OsSODB和OsAPX1基因在sst和hst1突變體中的轉(zhuǎn)錄水平較高,且在hst1中具有最高水平。在高度鹽(200 mM)脅迫下突變體sst中的轉(zhuǎn)錄水平要高于hst1和野生型植株。綜上所述,營養(yǎng)生長、光合作用、細(xì)胞滲漏、保水性、離子含量、脂質(zhì)過氧化、有機(jī)滲透溶質(zhì)、抗氧化酶活性在突變體sst和hst1都有一個(gè)較好的水平。sst的抗氧化活性的改善要好于hst1,暗示sst的耐鹽性可能與抗氧化活性途徑有關(guān)。hst1的K+/Na+穩(wěn)態(tài)的改善要好于sst,暗示突變體hst1可能通過調(diào)節(jié)離子途徑提高其耐鹽性。研究結(jié)果將為水稻SST和HST1基因的耐鹽機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。此外,所獲得的知識(shí)還將為今后的耐鹽性研究和育種計(jì)劃提供支持。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511
【圖文】：

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5 舒翠玲,郭燕翔,胡美茹,欒堯,沈倍奮;人CD28分子突變體的構(gòu)建和表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1999年02期

6 程淵,沈子威,趙南明,孫彤,王敖金,胡坤生;蜂毒突變體對(duì)紫膜質(zhì)子泵功能的影響[J];生物物理學(xué)報(bào);1997年01期

7 劉士輝,黃培堂,黃翠芬;組織型纖溶酶原激活劑突變體的構(gòu)建、表達(dá)及特性分析[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年04期

8 周松茂,李代璽,徐光華;水稻輻射突變體遺傳變異的初步研究[J];遺傳;1985年02期

9 丁小令;矮桿、優(yōu)質(zhì)的水稻突變體[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);1986年01期

10 K.S.McKenzie;金衛(wèi);;一個(gè)水稻長粒型品種的半矮稈突變體[J];核農(nóng)學(xué)通報(bào);1987年02期

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5 林植芳;彭長連;徐信蘭;林桂珠;張景六;;兩個(gè)新的水稻缺葉綠素b突變體光合作用的熱穩(wěn)定性[A];中國植物生理學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

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8 賈嬌;邢繼紅;董金皋;;擬南芥抗核盤菌突變體的篩選[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

9 李國柱;申慧芳;;輻射誘變選育苦蕎高黃酮突變體的研究[A];第六屆核農(nóng)學(xué)青年科技工作者學(xué)術(shù)交流會(huì)暨中國核學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)核農(nóng)學(xué)分會(huì)論文集[C];2011年

10 李文強(qiáng);陳坤明;;一個(gè)水稻卷葉突變體的表型分析與基因定位[A];從植物科學(xué)到農(nóng)業(yè)發(fā)展——2012全國植物生物學(xué)大會(huì)論文集[C];2012年

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3 《知識(shí)分子》公眾號(hào)主筆 邸利會(huì);基因編輯作物在中國該如何監(jiān)管[N];科技日?qǐng)?bào);2018年

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