發(fā)布時(shí)間：2024-06-29 13:15

　　植物為了抵御非生物逆境脅迫造成的傷害,體內(nèi)會產(chǎn)生各種應(yīng)對的作用機(jī)制,其中,泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)是最重要的機(jī)制之一。干旱是最常見的非生物逆境,嚴(yán)重危害小麥的產(chǎn)量。本研究在前期克隆小麥干旱脅迫響應(yīng)基因TaDIS1及功能初步分析的基礎(chǔ)上,通過酵母雙雜交技術(shù)篩選TaDIS1的互作蛋白及體內(nèi)、外驗(yàn)證,并對其互作蛋白進(jìn)行初步功能分析,最后通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)和降解實(shí)驗(yàn)解析其作用機(jī)理。取得以下研究結(jié)果:1.通過酵母雙雜實(shí)驗(yàn)篩選出TaDIS1的8個(gè)潛在互作蛋白,其中TaSTP是其互作蛋白之一,根據(jù)序列比對及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明該蛋白是一種逆境蛋白,可能與ABA調(diào)控途徑有關(guān)。TaSTP基因全長為887bp,包含89bp的5’UTR區(qū)、462bp的ORF和336bp的3’UTR區(qū)。2.為了排除酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的假陽性,我們通過BiFC,Pull-Down,CoIP實(shí)驗(yàn)對TaDIS1與TaSTP的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。在BiFC實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)TaDIS1和TaSTP在煙草葉片細(xì)胞的某一內(nèi)含體發(fā)出熒光,表明TaDIS1和TaSTP在細(xì)胞內(nèi)部互作;Pull-Down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TaDIS1在體外可以被TaSTP...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物響應(yīng)干旱脅迫的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 干旱脅迫對植物的影響
        1.1.2 植物響應(yīng)干旱脅迫的研究進(jìn)展
    1.2 泛素/26S蛋白酶體途徑的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 泛素化過程
        1.2.2 E3泛素連接酶的種類
    1.3 泛素/26S蛋白酶體途徑在逆境脅迫中的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 泛素/26S蛋白酶體途徑在植物應(yīng)對逆境脅迫中的作用
        1.3.2 E3泛素連接酶的研究現(xiàn)狀
    1.4 酵母雙雜交篩庫系統(tǒng)進(jìn)展
        1.4.1 酵母雙雜交篩庫的原理
        1.4.2 酵母雙雜交篩庫技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.4.3 酵母雙雜交篩庫技術(shù)研究現(xiàn)狀
    1.5 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
        1.5.1 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的原理
        1.5.2 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.5.3 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的研究現(xiàn)狀
    1.6 GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
        1.6.1 GST Pull-Down技術(shù)的原理
        1.6.2 GST Pull-Down技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.6.3 GST Pull-Down技術(shù)的研究現(xiàn)狀
    1.7 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
        1.7.1 免疫共沉淀技術(shù)的原理
        1.7.2 免疫共沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.7.3 免疫共沉淀技術(shù)的研究現(xiàn)狀
    1.8 體外泛素化實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
        1.8.1 體外泛素化實(shí)驗(yàn)原理
        1.8.2 體外泛素化實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀
    1.9 26S蛋白酶體降解途徑實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
    1.10 熒光定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
    1.11 本研究的目的意義及技術(shù)路線
        1.11.1 目的意義
        1.11.2 技術(shù)路線
第二章 小麥TaDIS1互作蛋白的篩選及鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要試劑和配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 誘餌載體pGBKT7 載體的構(gòu)建
        2.2.2 將文庫質(zhì)粒導(dǎo)入Y187 菌株
        2.2.3 從中國春的c DNA文庫篩選互作蛋白
        2.2.4 將篩選出的互作蛋白進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 自激活和毒性驗(yàn)證的結(jié)果與分析
        2.3.2 初步篩選出的互作蛋白的結(jié)果與分析
        2.3.3 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證的結(jié)果與分析
    2.4 討論
第三章 Ta DIS1與TaSTP互作關(guān)系的驗(yàn)證
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株,質(zhì)粒和試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 引物的設(shè)計(jì)
        3.2.2 載體的構(gòu)建
        3.2.3 BiFC實(shí)驗(yàn)和亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 Pull-Down實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 CoIP實(shí)驗(yàn)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 TaDIS1與TaSTP的定位情況
        3.3.2 TaDIS1與TaSTP的共定位分析
        3.3.3 蛋白的原核表達(dá)結(jié)果及分析
        3.3.4 體外互作驗(yàn)證的結(jié)果與分析
        3.3.5 體內(nèi)互作驗(yàn)證的結(jié)果與分析
    3.4 討論
第四章 TaDIS1的酶活分析及其底物蛋白的驗(yàn)證
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 質(zhì)粒和菌株
        4.1.2 主要試劑和配方
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)
        4.2.2 進(jìn)行定點(diǎn)突變
        4.2.3 載體構(gòu)建
        4.2.4 進(jìn)行體外泛素化實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 TaDIS1 和突變的酶活驗(yàn)證
        4.3.2 底物蛋白的驗(yàn)證與分析
    4.4 討論
第五章 TaSTP對逆境脅迫下的表達(dá)分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 熒光定量引物的設(shè)計(jì)
        5.2.2 小麥材料的的處理
        5.2.3 小麥RNA的提取
        5.2.4 cDNA的合成
        5.2.5 進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.3.1 RNA的質(zhì)量檢測
        5.3.2 TaSTP的表達(dá)模式分析
    5.4 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號：3997609