發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 01:19

　　 豬苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]是一種藥用真菌,具有利尿去水腫的作用;它的生長(zhǎng)經(jīng)歷有三個(gè)階段:菌核、菌絲、子實(shí)體,其中菌核為藥用部分,本論文通過研究豬苓菌核的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST),為深入研究豬苓菌核的形成機(jī)制,分析物種在基因組學(xué)上的差異提供理論依據(jù)。以采自陜西省佛坪縣的三年生豬苓菌核為原材料,通過EASY spin植物快速提取試劑盒提取總RNA,經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰,OD260/280在2.0-2.1之間,產(chǎn)量符合反轉(zhuǎn)錄的要求;利用SMART法成功構(gòu)建了豬苓菌核的cDNA文庫(kù),原始文庫(kù)滴度為6.55×106pfu/ml,重組率為94.26%,插入片段長(zhǎng)度均大于100bp,擴(kuò)增文庫(kù)滴度為1.821×1010pfu/ml,符合一個(gè)質(zhì)量較好的文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取500個(gè)單克隆進(jìn)行單方向測(cè)序,獲得高質(zhì)量序列共371條,平均長(zhǎng)度為383bp;經(jīng)聚類拼接后得到包含127條ESTs的共46個(gè)重疊群和244個(gè)單拷貝序列,形成了共290條單基因簇,文庫(kù)的冗余度為21.83%;參照植物基因功能目錄對(duì)照與nr數(shù)據(jù)庫(kù)已知功能序列相似性高的序列推測(cè)其蛋白質(zhì)具有的功能共分為11類,分別為蛋白質(zhì)合成、疾病/防御、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)途徑及次生代謝。僅有160條序列獲得一條或一條以上GO功能基因注釋;其中被注釋為細(xì)胞組分(Cellular component)的包括9種功能;被注釋為生物學(xué)過程(Biological process)的包括15種功能;被注釋為分子功能(Molecular function)的包括3種功能。將所得序列提交到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共有116個(gè)基因獲得了 Knumber,其中有98個(gè)基因被帶入到通路中,涉及到的通路共153條;其中基因參與最多的通路為代謝(metabolic pathway),共有22個(gè)基因參加;根據(jù)與nr數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白質(zhì)序列高同源性為原則,選取10條與nt/nr數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已登陸基因高同源性序列,并對(duì)其高同源性基因及其編碼蛋白進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)未知基因及蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.3
【部分圖文】：

圖１中國(guó)豬苓資源分布地圖??Ｆｉｇｌ?．Ｔｈｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｉｎ?Ｃｈｉｎａ??３有關(guān)豬苓在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究概況??近年來有關(guān)豬苓的遺傳多樣性、種群差異結(jié)構(gòu)、功能基因克隆分析等多物學(xué)研宄正在逐步開展。??劉開輝等［５－７］對(duì)三種不同形態(tài)豬苓菌核的ｒＤＮＡ?（１８ｓ?ｒＤＮＡ和ＩＴＳ１－５－ＩＴＳ２）和ｐ－ｔｕｂｌ進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)，結(jié)果表明三種形態(tài)的豬苓菌核的ｒＤ

圖２兩種方法提取豬苓菌核總ＲＮＡ??Ｆｉｇ２?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡｓ?ｆｒｏｍ?ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ?ｏｆ?Ｐ．?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｕｓｉｎｇ?ｔｗｏ?ｍｅｔｈｏｄｓ??如圖２所示，試劑盒法所提取的總ＲＮＡ，２８ｓ與１８ｓ十分清晰，亮度比約為??２：１，且５ｓ處的條帶比較清晰，說明ＲＮＡ的完整性比較好，未發(fā)生降解；而Ｔｒｉｚｏｌ??改良法所提取的總ＲＮＡ，?５ｓ處的條帶要明顯亮于２８ｓ與１８ｓ，且出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，??說明ＲＮＡ的完整性很差，己經(jīng)發(fā)生了降解。??表１不同方法提取豬苓菌核純度與產(chǎn)置比較??Ｔａｂｌｅ?１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｑｕａｌｉｔｙ?ａｎｄ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｍｅｔｈｏｄ??方法?樣品編號(hào)?＾?產(chǎn)量（Ｈｇ／ｇ）???Ｍｅｔｈｏｄｓ?Ｓａｍｐｌｅｓ?‘⑷？８０?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ??試劑盒法?１?２．０６?２．４６??ＥＡＳＹ?Ｓｐｉｎ?Ｐｌａｎｔ?ＲＮＡ?ｋｉｔ?２?２?０９?３?３１??ｍｅｔｈｏｄ??Ｔｒｉｚｏｌ?改良法?３?２．２４?６．４３??Ｉｍｐｒｏｖｅｄ?Ｔｒｉｚｏｌ?ｍｅｔｈｏｄ?４?２．２６?６．９４??純的ＲＮＡ樣品ＯＤ２６Ｇ／２８０應(yīng)在１．７－２．２之間，若ＲＮＡ樣品的ＯＤ２６〇／２８〇比值太??小，表明有蛋白質(zhì)或酚污染？，當(dāng)ＯＤ２６０／２８０大于２．２時(shí)，說明ＲＮＡ己經(jīng)水解成單核??酸了如表中所示，采用試劑盒法所提取的ＲＮＡ樣品ＯＤ值均在２．０－２．１之間，??說明ＲＮＡ純度較好；采用Ｔｒｉｚｏｌ改良法所提取的ＲＮＡ樣品ＯＤ值均大于２．２

ＬＤ－ＰＣＲ所得到的ｄｓ－ｃＤＮＡ經(jīng)蛋白酶Ｋ消化，Ｓｆｉ?Ｉ酶切及ＣＨＲＯＭＡ??ＳＰＩＮ－４００分級(jí)分離后，得到１６管修飾后的產(chǎn)物，１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到如??圖４所示：??■物．．丨．．．．???｜????：?—??ＢＨＨ??１－１６?修飾后的?ｄｓ－ｃＤＮＡ，Ｍｌ?ＤＬ１５０００?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｍ２?ＤＬ?２０００?Ｍａｒｋｅｒ??圖４?ｃＤＮＡ分級(jí)分離??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃＤＮＡ??如圖４所示，第９－１２管的ｃＤＮＡ片段長(zhǎng)度均大于７５０ｂｐ，合并這四管的產(chǎn)物??并進(jìn)行純化。??３．４原始文庫(kù)滴度與重組率檢測(cè)??原始文庫(kù)經(jīng)稀釋１００倍后進(jìn)行倒板培養(yǎng)，分別進(jìn)行滴度的測(cè)定及藍(lán)白斑篩選??（表?２）：??７??
【參考文獻(xiàn)】

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1 孔婷婷;高增貴;張碩;王敏;周艷波;王小皙;;玉米紋枯病菌全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[J];植物病理學(xué)報(bào);2014年06期

2 章文賢;蔣詠梅;賀望興;郭文燕;黃曉菊;鄭素云;;靈芝14-3-3蛋白基因的電子克隆與表達(dá)分析[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2013年05期

3 李雯瑞;梁宗鎖;陳德育;;豬苓生物學(xué)特性的研究進(jìn)展[J];西北林學(xué)院學(xué)報(bào);2012年06期

4 呂桂云;張海英;郭紹貴;許勇;;表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析方法及在植物抗病研究中的應(yīng)用[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年08期

5 劉開輝;鄧百萬;陳文強(qiáng);丁小維;彭浩;解修超;;比較DNA序列分析不同豬苓菌種的親緣關(guān)系[J];食用菌學(xué)報(bào);2009年03期

6 欒德琴;白云峰;包文斌;陳國(guó)宏;;基因本體論研究進(jìn)展及在生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中的應(yīng)用[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年04期

7 張希根;何川;張義正;;粗毛栓菌cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和漆酶基因的表達(dá)分析[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年06期

8 張震;王教瑜;杜新法;柴榮耀;毛雪琴;邱海萍;孫國(guó)昌;;稻曲病菌cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J];植物病理學(xué)報(bào);2008年05期

9 張曉東;張傳富;彭科峰;顧文杰;曹立群;王立群;;生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)研究進(jìn)展[J];生物信息學(xué);2006年03期

10 張小青;袁璟;肖亞中;洪宇植;唐超;;基于ITS序列的栓菌屬部分種的分子分類初步研究(英文)[J];菌物學(xué)報(bào);2006年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 徐海松;蛋白質(zhì)序列中的折疊和去折疊信息[D];北京工業(yè)大學(xué);2011年

2 張永紅;小麥條銹菌cDNA文庫(kù)構(gòu)建和表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 秦亞麗;豬苓遺傳多樣性及多糖合成酶-UGPase基因的克隆[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2866371