發(fā)布時間：2020-11-03 18:24

　　 隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展及人民生活水平的提高,植物油需求逐年增加,供需關(guān)系緊張,目前大部分植物油依賴從國外進口。棉花作為主要的纖維作物,在我國種植面積大,作為副產(chǎn)物的棉籽總產(chǎn)量巨大;棉籽具有豐富的蛋白質(zhì)、維生素E及不飽和脂肪酸,在保證棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)不受影響,也不增加耕地面積的前提下,提高棉籽的含油量及改良棉籽油脂肪酸組分,對增加我國植物油的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)是生物體內(nèi)三酰甘油(TAG)合成過程中最后一步反應(yīng)酶,也是限速酶;研究表明,超表達DGAT能夠提高油分在植物體內(nèi)的積累。本研究對本實驗室已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)GhDGAT1基因棉花后代(T_3~T_5)進行多年多點種植,驗證其表達的穩(wěn)定性,以期獲得純合的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因高油棉花種質(zhì)。根據(jù)不同脂肪酸的合成機理,選擇控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因GhFAD2-1,構(gòu)建RNAi載體,轉(zhuǎn)化棉花,以期創(chuàng)造高油酸低亞油酸棉花種質(zhì),并通過對其后代(T_2~T_4)多年多點種植,驗證其遺傳穩(wěn)定性。主要結(jié)果如下:(1)從7個αGP啟動子轉(zhuǎn)基因株系(αGP-GhDGAT1)和4個35S啟動子轉(zhuǎn)基因株系(35S-GhDGAT1)中,篩選到了2個單拷貝轉(zhuǎn)化事件AGP1與AGP2,均為轉(zhuǎn)αGP-GhDGAT株系。經(jīng)測定,AGP1與AGP2的表達量、酶活性及三酰甘油(TAG)含量均高于其陰性對照。通過對這2個株系的種子含油量進行多年多點測定,含油量比陰性對照高、且能夠穩(wěn)定遺傳給后代,種植于湖北鄂州的T_5代AGP1、AGP2兩個轉(zhuǎn)基因系與對照相比含油量分別提高3.55%、3.61%(P0.01)。同時這兩個株系的農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)及光合特性,與對照植株相比沒有顯著的差異。(2)構(gòu)建GhFAD2-1基因的RNAi載體并在棉花上進行遺傳轉(zhuǎn)化,共獲得GhF AD2-1轉(zhuǎn)基因陽性株系16個,14個轉(zhuǎn)化事件;經(jīng)T_2代初步篩選,篩選出FAD-5、FAD-11、FAD-14這3個高油酸低亞油酸的轉(zhuǎn)基因株系。(3)通過對FAD-5、FAD-11、FAD-14株系多年多點(T_2~T_4)的種植及脂肪酸測定,其中FAD-5、FAD-11的表型能夠穩(wěn)定遺傳給后代。根據(jù)Southern雜交結(jié)果,FAD-5為雙拷貝,FAD-11為三拷貝。2018年,種植于湖北武漢的T_4代兩個轉(zhuǎn)基因株系的油酸與對照相比(WT、FAD-11N)分別從18.18%、18.86%提高到58.92%、46.88%,亞油酸含量分別從51.54%、51.19%降低到15.27%、26.44%;與對照植株相比,轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)及光合特性沒有顯著差異。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S562
【部分圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文3 結(jié)果和分析3.1 超表達 GhDGAT1 基因植株的遺傳分析3.1.1 GhDGAT1 轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測提取部分 T3代轉(zhuǎn)基因植株 DNA，PCR 鑒定陽性。結(jié)果如圖 3.1，AGP（αGP-DGAT1）材料和 35S（35S-DGAT1）材料部分為陽性，陽性率約 50%左右，考慮到DNA 質(zhì)量對陽性鑒定結(jié)果的影響，后期對陰性植株重新提取 DNA 鑒定陽性，發(fā)現(xiàn)大部分植株均為陽性。將陽性植株與陰性植株分別標(biāo)記進行后續(xù)實驗。

精提基因組 DNA，取 20ng 用于酶切，最終 Southern 雜交的結(jié)果如圖3.2，種子特異啟動子啟動的 GhDGAT1（αGP-GhDGAT1）轉(zhuǎn)基因材料 AGP1、AGP2株系為單拷貝，35S 啟動子啟動的 GhDGAT1（35S-GhDGAT1）轉(zhuǎn)基因材料 35S-2 為四個拷貝（a），35S-4 為單拷貝（b）。單拷貝率較高，利于轉(zhuǎn)基因性狀穩(wěn)定遺傳。

圖 3.3 GhDGAT1 轉(zhuǎn)基因植株表達量（a）轉(zhuǎn)基因植株在葉片中的表達量；（b）轉(zhuǎn)基因植株在 30DPA 胚珠中的表達量；**表示在 0.01 水平上差異顯著（P<0.01）；Fig. 3.3 Expression level of GhDGAT1 transgenic plants(a) Relative expression in leaves of transgenic plants; (b) Relative expression in 30DPAovules of transgenic plants; **indicates significant difference at the 0.01 probability level (P＜0.01);W T A G P 1 A G P 2 3 5 S -2 3 5 S -40 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5n u l l陽 性DGAT酶活（U/g）
【參考文獻】

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本文編號：2868935