發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 14:41

　　 甘蔗是中國(guó)主要的糖料作物,干旱是限制可持續(xù)甘蔗生產(chǎn)的最具挑戰(zhàn)性的農(nóng)業(yè)問(wèn)題之一。ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的關(guān)鍵酶,其功能之一是能夠提高植物的抗逆性,SoACLA-1基因是編碼甘蔗ATP-檸檬酸裂解酶蛋白的一個(gè)亞基的基因。本課題組前期構(gòu)建了以玉米u(yù)bi為啟動(dòng)子的SoACLA-1基因的真核表達(dá)載體PUBTC-SoACLA-1,并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該載體轉(zhuǎn)入甘蔗品種ROC22中,獲得了轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗無(wú)性系。本研究是以野生型甘蔗品種ROC22和上述轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的T1、T2代作為材料,研究過(guò)量表達(dá)SoACLA-1基因在干旱脅迫和復(fù)水時(shí)對(duì)甘蔗相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響以及在不同脅迫天數(shù)下SoACLA-1基因和幾個(gè)響應(yīng)植物干旱脅迫的基因的表達(dá)情況,為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗的遺傳穩(wěn)定性及驗(yàn)證SoACLA-1基因的功能提供參考。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.導(dǎo)入的SoACLA-1基因在T1、T2代轉(zhuǎn)基因甘蔗中均發(fā)現(xiàn)有丟失現(xiàn)象。利用PCR擴(kuò)增標(biāo)記基因bar基因并測(cè)序,結(jié)果表明31個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因甘蔗品系在T1代中有25個(gè)品系能檢測(cè)到bar基因,而在T2代中則有21個(gè)品系能檢測(cè)到bar基因,即T1代的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為80.6%,T2代的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為84%。2.RT-PCR及抗除草劑篩選進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因甘蔗材料。利用RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明導(dǎo)入的SoACLA-1基因能在mRNA水平上高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)除草劑抗性篩選發(fā)現(xiàn),帶有標(biāo)記基因bar基因的轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗具有除草劑抗性。3.SoACLA-1基因能夠提高T1代轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱性。在甘蔗伸長(zhǎng)初期對(duì)轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗RT1、RT2、RT3、RT4和野生型甘蔗(WT)進(jìn)行0、3、6、9 d和復(fù)水3 d的干旱脅迫處理并利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)對(duì)葉綠素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等與抗旱性相關(guān)的4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),結(jié)果表明,5個(gè)甘蔗品系T1代抗旱性由強(qiáng)到弱依次為RT2RT4RT3RT1WT,旱后恢復(fù)能力由強(qiáng)到弱依次為RT1RT2RT4RT3WT;轉(zhuǎn)基因甘蔗品系RT2的SOD活性在整個(gè)干旱脅迫及復(fù)水過(guò)程中均維持在高于其他幾個(gè)轉(zhuǎn)基因品系及WT的水平,從POD活性來(lái)看,整個(gè)干旱脅迫過(guò)程轉(zhuǎn)基因品系RT4的POD活性均高于其他幾個(gè)品系,而RT2的POD活性在脅迫中后期升幅較大并顯著高于WT(P0.05)。在脅迫9d時(shí),轉(zhuǎn)基因品系的SoACLA-1基因表達(dá)量均高于WT。4.SoACLA-1基因能夠提高T2代轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱性且SoACLA-1在轉(zhuǎn)基因甘蔗中的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致響應(yīng)植物干旱脅迫的基因的上調(diào)。在甘蔗伸長(zhǎng)末期對(duì)轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗RT2、RT4品系和野生型甘蔗(WT)進(jìn)行干旱脅迫和復(fù)水處理,分別在干旱脅迫0、6、9 d和復(fù)水3d采集葉片進(jìn)行分析,并利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)對(duì)葉綠素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等與抗旱性相關(guān)的4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),結(jié)果表明,3個(gè)甘蔗品系的T2代抗旱性由強(qiáng)到弱依次為RT4RT2WT,旱后恢復(fù)能力由強(qiáng)到弱依次為RT2RT4WT;轉(zhuǎn)基因甘蔗品系RT2的SOD活性在干旱脅迫9 d和復(fù)水3 d時(shí)顯著高于WT,而RT2和RT4的POD活性在脅迫9 d均表現(xiàn)為顯著高于WT。從實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果來(lái)看,SoACLA-1基因和SCDR4基因在脅迫6 d時(shí)的表達(dá)量最高,且RT2與RT4在此時(shí)的SoACLA-1基因和SCDR4基因的表達(dá)量均顯著高于WT;P5CS基因與dhy基因的表達(dá)量則是在脅迫9 d時(shí)最高,且RT2與RT4此時(shí)的dhy基因顯著高于WT,而RT2的P5CS基因表達(dá)量在脅迫9 d時(shí)顯著高于WT。RT2品系的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量在脅迫6 d時(shí)高于WT,而RT4品系則是在9d是顯著高于WT�？梢�(jiàn),轉(zhuǎn)SoACLA-1基因甘蔗T2代干旱脅迫后的生理生化指標(biāo)的變化與幾個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的基因表達(dá)具有一定的相關(guān)性。5.綜合分析T1、T2代甘蔗的遺傳穩(wěn)定性及SoACLA-1基因的功能,得出SoACLA-1基因在甘蔗中雖有丟失現(xiàn)象,但隨著代數(shù)的增加可能會(huì)趨于穩(wěn)定,轉(zhuǎn)基因甘蔗能夠穩(wěn)定高效地表達(dá)bar基因和SoACLA-1基因,目標(biāo)性狀在T1、T2代中均得以表現(xiàn)說(shuō)明其目標(biāo)性狀也能穩(wěn)定遺傳,轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱性強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因甘蔗證明Soo4CLA-1基因具有提高抗旱性的功能。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S566.1
【部分圖文】：

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｓｔｒａｉｎｓ．??２．３．２轉(zhuǎn)Ｓ＾ＣＵ－７基因甘蔗的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果??用１．０％的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)所提取的甘蔗葉片總ＲＮＡ，結(jié)果顯示（圖２－２ａ）所提??取的ＲＮＡ具備完整的三條帶，從上往下依次為２８ＳＲＮＡ、１８ＳＲＮＡ和５ＳＲＮＡ、２８Ｓ??與１８Ｓ的條帶亮度比約為２：１，且用Ｉｍｐｌｅｎ?Ｐ３００?ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ微量分光光度計(jì)測(cè)得??的ＲＮＡ濃度５００－７００?ｎｇ／ｎＬ之間，ＯＤ２６Ｑ／ＯＤ２８（）比值１．８－２．０之間，說(shuō)明所提ＲＮＡ純度??較高，無(wú)蛋白質(zhì)殘留。〇Ｄ２６０／ＯＤ２３ｆｌ則是在２－２．２之間說(shuō)明無(wú)鹽類(lèi)物質(zhì)污染。即ＲＮＡ樣??品質(zhì)量純度等均符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求。??１４?

?甘廉Ｓｏ／ｌＧＬ／ｉ－／基因遺Ｔ６？提定性分析及功能驗(yàn)證??當(dāng)轉(zhuǎn)基因甘蔗和野生型甘蔗在含有２．５?ｍｇ／Ｌ草甘磷的分化培養(yǎng)基和含有２．５?ｍｇ／Ｌ??草甘磷的生根培養(yǎng)基上分別生長(zhǎng)１５ｄ?（圖２－３ａ）和３０ｄ?（圖２－３ｂ）后，轉(zhuǎn)基因甘蔗大部??分葉片仍為綠色且繼續(xù)生長(zhǎng)，而野生型甘蔗己完全枯萎變黃。用１％的草甘膦浸泡甘蔗??葉片時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浸泡１０?ｄ后，結(jié)果如圖２－３ｃ所示，野生型甘蔗葉片變黃程度均比轉(zhuǎn)基??因葉片嚴(yán)重。從以上結(jié)果可知，轉(zhuǎn)基因甘蔗具有抗草甘膦的特性，即載體上的標(biāo)記基因??ｔｏｒ基因存在于轉(zhuǎn)基因甘蔗中

３．４結(jié)果與分析??３．４．１干旱脅迫下甘蔗植株的形態(tài)變化??由圖３－ｌａ可看出，在干旱脅迫開(kāi)始前，甘蔗植株生長(zhǎng)正常，脅迫至６ｄ時(shí)各甘蔗植??株的葉片開(kāi)始變黃并下垂（圖３－ｌｂ）；經(jīng)過(guò)了?９?ｄ的水分脅迫后，所有植株的葉片明顯??枯黃萎縮，此時(shí)的水分脅迫程度己嚴(yán)重影響了甘蔗的生長(zhǎng)（圖３－ｌｃ）。然而在干旱脅迫??的整個(gè)過(guò)程中，各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系與ＷＴ的外在形態(tài)變化并無(wú)明顯差異。??ｌｉｆｔ??ａ?ｂｅ??圖３－１?ＴＶ脅迫下甘蔗植株的形態(tài)變化??ａ：下￥脅迫０ｄ甘蔗生長(zhǎng)狀況；ｂ：?Ｔ￥脅迫６?ｄ甘蔗生長(zhǎng)狀況；ｃ：?ＴＶ脅迫９?ｄ甘蔗生長(zhǎng)狀況??Ｆｉｇ．?３－１?Ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｕｎｄｅｒ?ｄｒｏｕｇｈｔ?ｓｔｒｅｓｓ??ａ：?Ｇｒｏｗｔｈ?ｓｔａｔｕｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｂｅｆｏｒｅ?ｄｒｏｕｇｈｔ?ｓｔｒｅｓｓ；?ｂ：?Ｇｒｏｗｔｈ?ｓｔａｔｕｓ?ｏｆ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?ｕｎ
【參考文獻(xiàn)】

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