發(fā)布時間：2020-11-07 10:41

　　 冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體。具有“補腎益肺,止咳化痰”之功效,是一種名貴中藥。由于其生理生化的特殊性和復雜性,目前其子實體形成機制研究得并不明確。本研究利用Illumina/Solexa HiSeq 2500反轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)對冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組進行測序、數(shù)據(jù)組裝、分析,發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草菌絲體、子實體與冬蟲夏草具有高同源性,而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低;差異表達分析發(fā)現(xiàn)9238個基因在冬蟲夏草菌絲體、子實體中均有表達,這相當于72.57%的重合度;經(jīng)鑒定,1003個基因為DEGs(差異表達基因),KEGG富集分析顯示這些DEGs富含核糖體途徑;有161個差異表達基因參與豐富了GO術(shù)語。子實體中有58個差異表達基因下調(diào),103個差異表達基因上調(diào),表明冬蟲夏草蛋白質(zhì)合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發(fā)生了改變,以及47個基因特異表達;還發(fā)現(xiàn)肌動蛋白和微管蛋白相關(guān)基因表達的改變可能在子實體發(fā)育中起作用。這些結(jié)果均與冬蟲夏草子實體形成相關(guān)。同時利用2-DE(雙向電泳)技術(shù)對冬蟲夏草的發(fā)育過程中的三個階段(菌蟲復合體、子座、整體)的蛋白質(zhì)組進行分析,篩選出5個穩(wěn)定存在的蛋白質(zhì)和3個具有顯著差異的蛋白質(zhì),這8種蛋白質(zhì)均在子座形成后出現(xiàn)。通過質(zhì)譜技術(shù)進一步鑒定了這8個蛋白質(zhì),對其進行功能注釋分析(GO、KEGG)后發(fā)現(xiàn),3個具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點1、斑點5、斑點6均與細胞構(gòu)成相關(guān),其中斑點1參與大量核苷酸結(jié)合和酶活性過程,斑點5參與了大量代謝過程和化合物結(jié)合過程,斑點6參與了大量代謝過程和細胞生長過程;5個穩(wěn)定存在的蛋白質(zhì)中斑點2、斑點3與刺激應(yīng)答、核苷三磷酸酶結(jié)合相關(guān),斑點4與有機氮化合物代謝、離子結(jié)合相關(guān),斑點7與生物調(diào)節(jié)和水解酶活性相關(guān),斑點8與物質(zhì)運輸和轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)。斑點1鑒定為肌動蛋白,GO注釋發(fā)現(xiàn)該蛋白大量參與了細胞、細胞區(qū)域、細胞組分、細胞內(nèi)、細胞內(nèi)部分等過程,KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其活躍的代謝途徑為磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、吞噬小體,提示肌動蛋白可能在冬蟲夏草的生長發(fā)育中其重要作用。還通過2-DE(雙向電泳)技術(shù)對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復合體、子座的蛋白質(zhì)組進行對比分析,篩選出野生冬蟲夏草特有的蛋白質(zhì),驗證了課題組前期冬蟲夏草正偽品指標性蛋白質(zhì),并基于蛋白質(zhì)層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草間的差異,為后續(xù)野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的鑒別研究奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S567.35
【部分圖文】：

53.3 差異表達和功能富集分析將冬蟲夏草菌絲體組和子實體組的所有 RNA-Seq PE 讀數(shù)分別與 O.sinensisCO18(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000448365.1/)的基因組序列比對，并由 StringTie 組裝�？偣步M裝了 11264 個基因組編碼基因和 233 個新基因。為了全面表征不同樣品 RNA-Seq 的表達模式，將每個基因的比對讀數(shù)的數(shù)量標準化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9238 個基因在冬蟲夏草菌絲體、子實體、小金蝠蛾幼蟲及冬圖 1.從冬蟲夏草菌絲體和子實體獲取的四個樣本的 KOG 分類和表達分析 A：裝配基因的 KOG 分類;B：六個樣品 RNA-Seq 的主成分分析; C：表達轉(zhuǎn)錄本的維恩圖。Figure. 1. KOG classification and expression analysis of four samples from mycelium and Fruiting body ofOphiocordyceps sinensis. A: KOG classification of assembly genes; B: principal component analysis ofRNA-seq in six samples; C: Venn diagram expressing transcripts.

GO 富集也證實了這一結(jié)果。DEGs 的主要 GO 術(shù)語包括大分子復合物（102 個基因），有機物質(zhì)生物合成過程（88 個基因），生物合成過程（88 個基因），細胞生物合成過程（81 個基因）和有機氮化合物代謝過程（81 個基因），見圖 2。DEGs 的富集分析發(fā)現(xiàn)劇烈變化的基因主要富集在核糖體的結(jié)構(gòu)成分、核糖體亞基、蛋白酶體核心復合體、MCM 復合體、核糖核蛋白復合體途徑。有 161 個差異表達基因參與豐富了 GO 術(shù)語。 子實體中有 58 個基因下調(diào)，另外 103 個基因上調(diào)。這些結(jié)果表明，冬蟲夏草蛋白質(zhì)合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發(fā)生改變。分析發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中還有 47 個基因特異表達（特異表達基因，SEG），包括非核糖體肽合成酶，細胞色素 P450，HSP70 家族伴侶，乙醛酸酶家族蛋白，細胞壁相關(guān)蛋白，乙醛酸酶家族蛋白和 推定的琥珀酰-CoA 連接酶編碼基因。GO 分類結(jié)果表明，有 8 個特異表達基因與細胞部分相關(guān)。并且有 62 個基因在菌絲體中特異性表達，包括膜聯(lián)蛋白，核糖體 RNA 加工蛋白 12 編碼基因。

3.5 肌動蛋白和微管蛋白相關(guān)基因肌動蛋白基因(MSTRG.3317)的表達水平在冬蟲夏草中平均表達豐度為 45.25，菌絲體組平均表達豐度為 155.24。微管蛋白/ FtsZ 蛋白編碼基因(MSTRG.3823，MSTRG.689管蛋白/ FtsZ 家族蛋白(EQL01373.1)編碼序列。子實體和菌平均表達水平分別為 1748.13 和 574.04。MSTRG.6894 為微基因表達從菌絲體組的 27.18 上調(diào)至子實體組的 78.95。表蛋白相關(guān)基因表達的改變可能在子實體發(fā)育中起作用。圖 3 子實體發(fā)育候選基因的表達模式。根據(jù) HemI 工具包的 log2FC 值繪制表達水平計算 CS 樣品組和 HH 樣品組之間的 Log2FC。Figure. 3.Expression patterns of candidate genes for fruiting body development.Heat maps are drawn based on the log2FC values of the HemI toolkit. The Log2set and the HH sample set was calculated based on the expression level of each g
【參考文獻】

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本文編號：2873829