發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 09:50

　　 黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)為唇形科黃芩屬藥用植物,根入藥。主要分布于我國(guó)東北、華北、西北等地。但不同產(chǎn)地黃芩由于生態(tài)環(huán)境不同導(dǎo)致藥材質(zhì)量差異很大,嚴(yán)重影響了黃芩藥材原料及其產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),水分是影響黃芩藥材質(zhì)量形成的主要限制性生態(tài)因子,適度干旱脅迫可促進(jìn)黃芩藥效成分積累。因此,本研究在此基礎(chǔ)上,從植物生理與分子生態(tài)學(xué)的角度,系統(tǒng)開展黃芩苷對(duì)干旱脅迫響應(yīng)規(guī)律研究,探討黃芩藥材質(zhì)量形成的分子生態(tài)機(jī)制,對(duì)提升黃芩精細(xì)化栽培技術(shù)、實(shí)現(xiàn)藥材質(zhì)量調(diào)控具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究首先探索長(zhǎng)期干旱脅迫對(duì)黃芩苷的影響,并在此基礎(chǔ)上,分別對(duì)黃芩苷積累的關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行短期干旱脅迫和短期干旱脅迫及復(fù)水研究,尋找干旱脅迫對(duì)黃芩苷積累的作用規(guī)律,并利用高通量組學(xué)的方法研究黃芩對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,同時(shí)與光合生理、抗性生理研究相結(jié)合,揭示黃芩苷積累對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的分子生理生態(tài)機(jī)制,旨在為推進(jìn)黃芩藥材質(zhì)量生態(tài)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1.利用Design expert 8.05b軟件Box-Behnken法對(duì)單因素下微波輔助提取黃芩藥效成分進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析,得到最佳的提取條件:提取時(shí)間3.3 min,提取溫度79.40℃,液料比32.60 mL/g,乙醇濃度66.30%。在該條件下,黃芩藥效成分得率為19.79%,與軟件預(yù)測(cè)得率差異較小,此方法為研究黃芩次生代謝產(chǎn)物合成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。2.通過人工模擬降雨對(duì)一、二年生盆栽黃芩長(zhǎng)期干旱脅迫研究表明,重度干旱脅迫顯著抑制黃芩根生長(zhǎng),而輕度干旱脅迫對(duì)黃芩根生長(zhǎng)無顯著影響。長(zhǎng)期干旱脅迫對(duì)黃芩苷含量影響較小,但均可提高黃芩素含量。二年生黃芩在6月和9月黃芩苷含量出現(xiàn)雙高峰,并且對(duì)干旱脅迫有明顯的應(yīng)答規(guī)律,該時(shí)期可能為黃芩次生代謝受水分調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)期。此外,黃芩苷對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)規(guī)律具有短時(shí)性,可能是黃芩苷對(duì)干旱響應(yīng)的次生代謝補(bǔ)償機(jī)制。3.以二年生營(yíng)養(yǎng)期和生殖期黃芩為研究材料,分別進(jìn)行短期漸進(jìn)性干旱脅迫和短期干旱脅迫及復(fù)水研究,結(jié)果表明:黃芩苷含量受干旱脅迫調(diào)控作用明顯,輕、中度干旱脅迫階段黃芩苷顯著積累,重度干旱脅迫抑制了黃芩苷的合成,復(fù)水后,黃芩苷合成受抑制作用減弱。但干旱脅迫嚴(yán)重抑制營(yíng)養(yǎng)期黃芩根生長(zhǎng)。因此,生殖生長(zhǎng)期可作為黃芩水分調(diào)控的潛在最佳時(shí)期。4.通過對(duì)黃芩光合生理、抗性生理與黃芩苷相關(guān)性分析表明,干旱脅迫前期黃芩Pn、Gs和Tr受影響較小,隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng),實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSII降低,光合作用減弱,MDA開始大量積累,細(xì)胞膜受損,黃芩激活抗氧化酶系統(tǒng),SOD、POD和CAT活性增強(qiáng),滲透調(diào)節(jié)物Pro、SS和SP含量增加,此時(shí)黃芩苷和黃芩素含量均顯著增加。但是在重度干旱脅迫下,Pn、Gs和Tr受抑制顯著,同時(shí)非光化學(xué)猝滅系數(shù)NPQ顯著增加,MDA含量持續(xù)升高,SOD、POD和CAT活性明顯受到抑制,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)SP含量降低,此時(shí),黃芩苷含量降低,而黃芩素含量升高,表現(xiàn)出明顯的黃芩苷與黃芩素代謝轉(zhuǎn)化對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。5.通過對(duì)干旱脅迫黃芩次生代謝合成途徑關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL和CHS活性研究表明:四種關(guān)鍵酶對(duì)黃芩苷合成發(fā)揮重要作用,其中與黃芩素相比,黃芩苷積累受合成途徑關(guān)鍵酶影響較大。短期、輕中度干旱脅迫能夠不同程度增強(qiáng)PAL、C4H、4CL和CHS酶活性,促進(jìn)黃芩苷積累。長(zhǎng)期、重度干旱脅迫會(huì)抑制4種酶的活性,黃芩苷合成受抑制。PAL和CHS對(duì)長(zhǎng)期干旱脅迫黃芩苷調(diào)控作用明顯;而C4H、CHS和PAL分別對(duì)營(yíng)養(yǎng)期、生殖期黃芩苷調(diào)控作用明顯。6.以18SrRNA為內(nèi)參基因,構(gòu)建sbPAL、sbC4H、sb4CL、sbCHS、sbCHI、sbFNS、sbUBGAT和sbGUS等8個(gè)黃芩苷合成途徑關(guān)鍵酶基因?qū)Ω珊得{迫表達(dá)時(shí)序圖譜結(jié)果表明:干旱脅迫對(duì)關(guān)鍵酶的基因表達(dá)影響顯著。總體表現(xiàn)為,短期干旱脅迫可促進(jìn)關(guān)鍵酶基因表達(dá),重度干旱脅迫會(huì)抑制基因表達(dá),但對(duì)不同基因影響程度不同。其中,sbFNS對(duì)長(zhǎng)期干旱脅迫黃芩苷調(diào)控作用明顯;sbCHS和sbPAL基因表達(dá)模式分別與二年生營(yíng)養(yǎng)期、生殖期黃芩藥效成分積累模式相近,受干旱脅迫影響表達(dá)量變化顯著,在黃芩苷合成過程中發(fā)揮重要作用,可作為黃芩質(zhì)量調(diào)控重要候選基因。7.利用Illmina 4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)對(duì)照、輕度、中度和重度干旱脅迫黃芩根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析:共獲得93.59 GB數(shù)據(jù),拼接注釋得到57307個(gè)unigenes。有大量差異表達(dá)基因被富集到碳代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷代謝。包括大量活性氧清除基因、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成基因,研究還發(fā)現(xiàn),MYB(c49842.graph_c0)和WRKY(c59576.graph_c2)可能對(duì)干旱脅迫下黃芩苷積累具有重要的調(diào)控作用。綜上,短期干旱脅迫可作為提高黃芩藥材質(zhì)量的有效手段,為精細(xì)化栽培提供技術(shù)參考。然而黃芩苷生物合成與積累并非受單一因子決定,而是光合、激素、酶活、基因表達(dá)等多因素共同作用的結(jié)果。后續(xù)研究將著重開展干旱脅迫下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與黃芩苷次生代謝途徑之間的關(guān)系,闡明轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

pathway of up-stream phenylpropane metabolism. (II) Acrial parts metabolic pathway of flavones. (III) The special metabolicpathway of baicalin in root.圖.1 黃芩中黃酮類化合物合成途徑Fig.1 Proposed pathways for flavones synthesis in Scutellaria baicalensis Georgi.

本研究技術(shù)路線圖

圖 4.1 RNA-seq 建庫(kù)流程Fig.4.1 Flowchart of RNA-seq據(jù)組裝y 軟件[241]將 clean reads 拼接成 Unigene，其原理為首先這些小片段（K-mer）延伸為較長(zhǎng)重疊片段（Contig），長(zhǎng)的序列即為 Unigene，而不同 Contig 之間的重疊片段采用 De Bruijn 方法和 Claen reads 序列信息識(shí)別轉(zhuǎn)錄本 功能注釋42]軟件將 Trinity 拼接所形成的 Unigene 與 NR[243]、GOCOG[247]、eggNOG[248]、KEGG[249]和 TAIR 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)氨基酸序列，利用 HMMER[250]與 Pfam[251]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比，NR 為 NCBI 中非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)；Swiss-Pro 為 EB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)；COG（Clusters of Orthologous Group-直系
【參考文獻(xiàn)】

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