發(fā)布時間：2024-06-05 04:16

　　鹽害是嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育的非生物因素之一,土壤的鹽漬化會使植物體內(nèi)大量積累Na+,進(jìn)而影響植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量。然而有些植物能在鹽漬環(huán)境中正常生長,因此對其耐鹽基因的研究有助于深入了解植物的耐鹽機(jī)制,并用于提高植物的耐鹽性。GmsSOS1是本課題組從栽培和野生大豆中克隆出的編碼細(xì)胞質(zhì)膜上Na+/H+離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。Nie等(2015)從野生大豆中克隆出GmsSOS1,并將GmsSOS1基因轉(zhuǎn)入SOS1突變型的擬南芥突變體中進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),證明了GmsSOS1在擬南芥中表達(dá)能顯著提高其耐鹽性;Zhao等(2016)通過酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明GmsSOS1在酵母中表達(dá)可顯著提高酵母的耐鹽性。本實(shí)驗(yàn)主要通過發(fā)根技術(shù)將GmsSOS1基因在大豆發(fā)根(包括發(fā)根組合植株和子葉發(fā)根)中過表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證GmsSOS1在耐鹽性中的功能。將GmsSOS1基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCambia1304中,并通過發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將GmsSOS1轉(zhuǎn)導(dǎo)至大豆細(xì)胞中,經(jīng)PCR鑒定證明植物表達(dá)載體含有GmsSOS1的T-DNA區(qū)域已整合到大豆基因組中,GmsSOS1在CaMV35S啟動子的作用下在發(fā)根中過表達(dá)。選取...

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 鹽脅迫對植物的危害以及耐鹽的主要機(jī)制
        1.1 鹽脅迫對植物的影響
            1.1.1 離子毒害
            1.1.2 滲透脅迫與滲透調(diào)節(jié)
            1.1.3 氧化脅迫
            1.1.4 光合作用受阻
        1.2 植物耐鹽的生理機(jī)制
            1.2.1 滲透調(diào)節(jié)
            1.2.2 營養(yǎng)離子平衡機(jī)制
            1.2.3 活性氧的清除機(jī)制
            1.2.4 激素調(diào)節(jié)機(jī)制
    2 高等植物耐鹽相關(guān)基因研究進(jìn)展
        2.1 滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因
        2.2 離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因
        2.3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因
    3 植物耐鹽基因SOS1的研究進(jìn)展
        3.1 質(zhì)膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因SOS1分析
        3.2 高等植物SOS1的研究進(jìn)展
        3.3 GmsSOS1基因及蛋白的生物信息學(xué)分析
    4 提高植物耐鹽性的途徑
    5 發(fā)根農(nóng)桿菌的研究及其應(yīng)用
        5.1 發(fā)根農(nóng)桿菌及其Ri質(zhì)粒
        5.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的應(yīng)用
    6 本研究的目的和意義
第二章 GmsSOS1基因的克隆以及表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 酶制劑及其他生化試劑
            1.1.4 實(shí)驗(yàn)引物
            1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.6 主要試劑的配制
        1.2 試驗(yàn)方法
            1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)
            1.2.2 大豆根部組織總RNA的提取
            1.2.3 總RNA完整性檢測
            1.2.4 cDNA第一鏈的合成(RT-PCR)
            1.2.5 GmsSOS1基因全長的PCR克隆
            1.2.6 目的片段的回收
            1.2.7 質(zhì)粒的提取
            1.2.8 大腸桿菌(DH5α)菌株感受態(tài)的制備
            1.2.9 目的片段和目的載體的雙酶切
            1.2.10 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 大豆GmsSOS1基因全長的克隆及pCambia1304-SOS1載體的構(gòu)建
            2.1.1 RNA提取
            2.1.2 大豆GmsSOS1基因CDS片段的克隆
            2.1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 大豆GmsSOS1基因的測序
    3 討論
第三章 轉(zhuǎn)GmsSOS1基因發(fā)根體系的建立
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 酶及其他生化制劑
            1.1.4 熒光定量PCR引物
            1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.6 緩沖液及主要溶液配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌(K599)感受態(tài)的制備
            1.2.2 目的載體的轉(zhuǎn)化
            1.2.3 實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)以及鹽處理
            1.2.4 發(fā)根基因組DNA的提取
            1.2.5 基因組中目的基因的檢測
            1.2.6 熒光定量樣品的獲取
            1.2.7 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 發(fā)根中目的基因的鑒定
        2.2 熒光定量PCR反應(yīng)
        2.3 鹽脅迫下大豆GmsSOS1基因表達(dá)量的變化
    3 討論
第四章 過表達(dá)GmsSOS1基因大豆發(fā)根組合植株耐鹽性分析
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 試驗(yàn)方法
            1.2.1 大豆幼苗的培養(yǎng)
            1.2.2 發(fā)根組合苗的培養(yǎng)
            1.2.3 發(fā)根組合苗的鹽處理
            1.2.4 幼苗根和葉相對電解質(zhì)滲漏率的測定
            1.2.5 Na⁺、K⁺含量的測定
            1.2.6 葉綠素含量的測定
            1.2.7 真葉枯萎率的測定
            1.2.8 相對含水量的測定
            1.2.9 抗氧化酶活性的測定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 大豆品系Lee68和N23674耐鹽性比較
            2.1.1 大豆品系Lee68和N23674鹽處理后形態(tài)特征
            2.1.2 大豆品系Lee68和N23674鹽處理后真葉的相對含水量
            2.1.3 大豆品系Lee68和N23674鹽處理后根和真葉的相對電導(dǎo)率
        2.2 大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)根組合植株的耐鹽性探究
            2.2.1 NaCl處理對大豆組合植株表型的影響
            2.2.2 NaCl處理對大豆組合植株真葉相對含水量的影響
            2.2.3 NaCl處理對大豆組合植株根和葉片相對電導(dǎo)率的影響
            2.2.4 NaCl處理對大豆組合植株發(fā)根、莖、葉中離子含量的影響
            2.2.5 NaCl處理對大豆組合植株根和葉片抗氧化酶活性的影響
            2.2.6 NaCl處理對大豆組合植株葉綠素含量的影響
    3 討論
第五章 過表達(dá)GmsSOS1基因大豆子葉發(fā)根耐鹽性分析
    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌液和載體
            1.1.3 酶制劑及其他生化試劑
            1.1.4 實(shí)驗(yàn)引物
            1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
            1.2.2 大豆子葉的獲取
            1.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
            1.2.4 子葉發(fā)根的誘導(dǎo)、培養(yǎng)以及鹽處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 子葉發(fā)根鹽處理后表型的變化
        2.2 轉(zhuǎn)GmsSOS1基因子葉發(fā)根目的基因的驗(yàn)證
        2.3 NaCl處理對轉(zhuǎn)GmsSOS1子葉發(fā)根根長和根鮮重的影響
        2.4 NaCl處理對轉(zhuǎn)GmsSOS1子葉發(fā)根Na⁺和K⁺含量的影響
    3 討論
全文結(jié)論
創(chuàng)新性
存在的問題與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表論文



本文編號：3989634