發(fā)布時間：2020-11-10 17:48

　　 蒙古白麗蘑Leucocalocybe mongolica(S.Imai)X.D.YuY.J.Yao原名蒙古口蘑Tricholoma mongolicum S.Imai,俗稱白蘑、口蘑,是東北亞地區(qū)久負盛名的野生珍稀食藥用菌,是蒙古高原的特有種。通常以蘑菇圈的形式生長在草原上。由于它的美味以及其強身健體、藥食同源的屬性,蒙古白麗蘑被當?shù)鼐用窈蜕倘藗兟訆Z性的采集、出售,導致它的生境持續(xù)受到影響,資源日漸減少。蒙古白麗蘑的生存遭遇前所未有的威脅以及處于瀕臨滅絕的狀態(tài)。本文在野外調(diào)查的基礎之上,從生理學、遺傳學以及分子生態(tài)學角度探索如何保護瀕危的珍稀菌物物種,充分合理利用野生資源的問題。關于蒙古白麗蘑的系統(tǒng)學地位,作為目前白麗蘑屬的單種屬的唯一成員,對其形態(tài)特征和基因信息的研究是屬和種分類的關鍵。因為前期的研究僅涉及到LSU單一片段,而如今譜系一致的系統(tǒng)發(fā)育學種識別法(GCPSR)作為一個重要的研究手段影響著真菌的分子系統(tǒng)學。我們實施了一個基于最大似然法的多基因聯(lián)合建樹的分析方案,三個核糖體DNA區(qū)域(LSU,SSU,ITS)和線粒體區(qū)域(mtSSU)被選擇用于對蒙古白麗蘑的分類學地位的界定。涉及到83份蕈菌樣本,結(jié)果顯示香蘑Lepista與蒙古白麗蘑在分子水平上存在較近的親緣關系,而香蘑屬Lepista和杯傘屬Clitocybe都是多系類群。生理學特性方面,首先,孢子萌發(fā)機制的問題,選擇5種培養(yǎng)基對蒙古白麗蘑孢子懸浮液的萌發(fā)狀況進行了檢測,其中改良的孟加拉紅馬鈴薯培養(yǎng)基較利于孢子萌發(fā)。菌蓋的直徑與孢子萌發(fā)出菌落的數(shù)目呈現(xiàn)出正相關性。其次,核相的變化問題,采用熒光顯微鏡法觀察了其核相交替現(xiàn)象。再次是生物學特性的研究,野外采集到的擔子果經(jīng)組織分離獲取得到菌株,研究了其生物學特性,碳源、氮源、無機鹽、生長因子單因素試驗篩選每組最優(yōu)的三個因子,綜合菌絲日生長速率和生長勢,碳源選擇麥芽糖、淀粉和纖維二糖;氮源選擇酵母浸膏,牛肉粉,牛肉浸膏;無機鹽選擇K_2HPO_4,Fe_2(SO_4)_3以及不添加;生長因子選擇糙皮側(cè)耳煮汁、胡蘿卜煮汁、豆芽煮汁。對上述四個因素分別進行四因素三水平的正交試驗,并確定了最佳菌絲生長條件。4個因素對正交體系的影響順序是生長因子無機鹽氮源碳源,方差齊性檢驗展示了四個因子的極顯著差異性。菌絲營養(yǎng)生長最優(yōu)條件為淀粉、牛肉膏、2%的胡蘿卜煮汁、不添加無機鹽�；�于正交試驗的優(yōu)化所得的培養(yǎng)基基礎之上研究其最佳溫度和初始pH值,其結(jié)果為pH=6.5和25℃。蒙古白麗蘑在全球分布中僅在有限的范圍內(nèi),由于特殊的棲息地,對其生理學研究具有必要性,實驗顯示無機鹽和pH是影響菌絲生長的重要因素。蒙古白麗蘑的轉(zhuǎn)錄組和基因組方面,生物信息數(shù)據(jù)庫查詢不到相關數(shù)據(jù),制約了對其深入的研究�；�于簡化基因組的測序分析表明RAD-seq不適用于蒙古白麗蘑SSR的開發(fā)。特定的DNA條形碼像IGS1、ITS、RPB2和mtSSU在蒙古白麗蘑10個樣本之間沒有表現(xiàn)出理想的多態(tài)性。所以,實施了轉(zhuǎn)錄組從頭測序,轉(zhuǎn)錄本獲取的意義是為了促進基因的發(fā)現(xiàn),了解活性物質(zhì)生物合成的生理機制,識別微衛(wèi)星位點以期作為探索蒙古白麗蘑遺傳多樣性的分子標記。依托Illumina公司的末端配對測序法獲取42622958個clean data,拼接為37302個contigs,基于對已知蛋白質(zhì)的相似性搜索,13821個unigenes得到了較好的BLAST結(jié)果,對這些unigenes使用7個公共數(shù)據(jù)庫進行了注釋,6642個unigenes被注釋到基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)的三個功能性分組即分子功能、生物過程、細胞組成。使用直系同源簇比對的(COG)方法對一些未知基因進行預測,3914個unigenes被預測到25個COG分類項目中。4019個unigenes注釋到了KEGG通路數(shù)據(jù)庫,其中3110個在KEGG數(shù)據(jù)庫中較好的匹配,被分類于5個主要分組,包括35個KEGG通路,同時又識別出了57個涉及萜類、甾醇類、不飽和脂肪酸類生物合成通路中的基因,次生代謝產(chǎn)物引起了越來越多的關注,轉(zhuǎn)錄組注釋得到的活性物質(zhì)代謝合成途徑為建立了生化合成平臺提供了基礎性的研究數(shù)據(jù)。另外,對轉(zhuǎn)錄本進行了碳水化合物酶數(shù)據(jù)庫的注釋,結(jié)果顯示總計446個碳水化合物酶相關的基因得以注釋,和其他已公布的有代表性生態(tài)類型的蕈菌相比,碳水化合物酶結(jié)合模塊(CBM)的數(shù)目相對其他蕈菌少,CE11、GT19、GT51、GT56、GH131、GH133、GH135在其他蕈菌中未被發(fā)現(xiàn),這些特征性的碳水化合物酶基因可能在蒙古白麗蘑的營養(yǎng)基物的代謝過程中扮演一個重要的角色�；�于組裝得到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù),搜尋得到1860個微衛(wèi)星位點,這些位點是蒙古白麗蘑候選分子標記。蒙古白麗蘑遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的研究方面,我們通過2015年7月到2017年9月七次實地采樣對蒙古白麗蘑主要分布地進行資源調(diào)查,采樣范圍主要圍繞錫林郭勒草原、呼倫貝爾草原、貢格爾草原、張家口壩上草原四大草原區(qū)�；�于轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù),90個EST-SSR引物使用eprimer3 v6.6.0程序進行開發(fā),使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分型技術(shù)從中搜尋出8個多態(tài)性高的引物對�；�于8個多態(tài)性的微衛(wèi)星引物進行毛細管電泳分型,獲取得到17個地理種群223個個體的402個等位基因。種群的等位基因數(shù)目從11到31個,平均每個種群24個,種群觀測雜合度(Ho)從0.300到0.875,期盼雜合度(He)0.188到0.621。分子方差分析(AMOVA)表明,14.19%的遺傳變異存在于種群之間(p0.001),而85.81%存在于種群內(nèi)。17個地理種群平均的遺傳分化系數(shù)F_(ST)為0.171,顯示在種群間較低的遺傳分化水平。曼特爾測試結(jié)果顯示種群的遺傳距離和地理距離缺乏顯著相關性(r=0.049,p=0.28)�；�于8個微衛(wèi)星數(shù)據(jù)產(chǎn)生的UPGMA系統(tǒng)聚類圖顯示17個種群在0.8的Nei's相似性系數(shù)上分成了3個姐妹群。223個樣本基于貝葉斯算法進行Structure分析,結(jié)果顯示三個血統(tǒng)起源,將三個血統(tǒng)譜系在17個地理種群的分布情況映射到的地圖坐標中進行可視化分析。17個種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)使用AIS軟件中的IGLS程序進行實現(xiàn)。綜合分析表明,生境特征與種群遺傳多樣性及其種群結(jié)構(gòu)有較大的相關性。另外,Barrier分析表明,整個分布區(qū)的南部區(qū)域(經(jīng)緯度范圍為43.2-45N,116.2E-118E)呈現(xiàn)出幾個空間上分割的片狀分布區(qū)。生境破碎化顯現(xiàn)出連續(xù)生境被破壞成幾個空間上遙遠的斑塊分布,保持和豐富種群的遺傳多樣性是蒙古白麗蘑就地保育的關鍵。本研究獲得了種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的數(shù)據(jù),將為保育措施的制定提供依據(jù)。就地保護時,那些遺傳多樣性高的居群和區(qū)域應列為優(yōu)先保護地區(qū),以最大限度地保護其遺傳多樣性。關于蒙古白麗蘑的開發(fā)利用方面,目前擔子果人工栽培技術(shù)缺乏實質(zhì)性的突破,發(fā)酵技術(shù)作為資源利用的集約化途徑極具前景。本文對液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵進行了研究。液態(tài)發(fā)酵最優(yōu)的配方依次通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡坡度實驗、響應面試驗進行確定,其配方是蔗糖35.13 g/L、黃豆粉16.55 g/L、玉米漿粉33 g/L。在此基礎上優(yōu)化所得最佳培養(yǎng)條件為25℃、初始pH 6.5、120 rpm、裝液量75 mL/250 mL、接種量12.5%。為了篩選固態(tài)發(fā)酵的最佳基質(zhì),對玉米粒、麥粒等5種基質(zhì)進行了篩選,結(jié)果顯示玉米粒是較優(yōu)良的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),建立了玉米粒為主要基質(zhì)成分的固態(tài)發(fā)酵工藝流程。使用擔子果作為參照評估了兩種發(fā)酵方式的產(chǎn)物的營養(yǎng)成分、揮發(fā)性組分。GC-MS結(jié)果顯示21種揮發(fā)性成分可能是擔子果的呈味物質(zhì)。固態(tài)發(fā)酵前后的活性成分做了測定,檢測顯示黃酮類、多糖類、三萜類、甾醇類、酚類物質(zhì)的含量都相對發(fā)酵前較大程度的提高。蒙古白麗蘑固態(tài)發(fā)酵技術(shù)值得更深入的研究推廣。
【學位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

1.5 本文研究主要技術(shù)路線圖本文研究的主要技術(shù)路線圖見圖 1.1 所示，其在系統(tǒng)學地位確定的基礎之上，通過生理學、遺傳學、分子生態(tài)學的三個方面探索其致瀕機制，從而制定相應的保育策略。最后，在保育的基礎之上，如何合理的、可持續(xù)性的利用蒙古白麗蘑資源，最大限度的發(fā)揮其社會經(jīng)濟學價值也是本文研究的初衷。

（ITS 區(qū)）片段 685 bp，線粒體小亞基（mtSSU 區(qū)）片段 806 bp，核糖體大 區(qū)）片段 1010 bp，核糖體小亞基 18s （SSU 區(qū)）片段 1481 bp。四片段進行聯(lián)2 bp。對其進行 DAMBE 飽和度分析，其分析結(jié)果如表 2-5 所示，其堿基替換飽圖 2.1 所示。ISS 小于 ISS.c 且 p=0.0000，表示序列替換未飽和是極其顯著的合建樹分析是可行的。表 2-5 DAMBE 的分析Tab.2-5 The analysis of DAMBEISS ISScSym T DF P ISScASym T DF 0.263 0.849 54.014 3882 0 0.838 52.966 3882 0.314 0.843 33.629 3882 0 0.760 28.375 3882 0.347 0.828 23.644 3882 0 0.670 15.906 3882 0.408 0.809 16.033 3882 0 0.556 5.909 3882 esting whether the observed Iss is significantly lower than Iss.cis Iss.c assuming a symmetrical topology. IssAsym is Iss.c assuming an asymmetrical topology.

圖 2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹簡化示意圖Fig.2.3 The Simplified schematic diagram of Phylogenetic tree
【參考文獻】

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本文編號：2878183