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基于SSR分子標記的海棠種質資源分離與鑒定

發(fā)布時間:2020-11-11 07:41
   本研究是為最終達成對海棠進行精準鑒定以及對全部海棠品種進行系統(tǒng)分類這個大目標而做出的初步分析和研究。本研究利用了SSR分子標記技術,對山東省內海棠品種進行了種質的分離與鑒定。本研究通過從薔薇科蘋果屬(Malus)開發(fā)的引物中篩選出的18對SSR引物,對從山東濰坊昌邑海棠苗木專業(yè)合作社、山東省林業(yè)高科技創(chuàng)新園、山東省林業(yè)廳院內、山東東營利津縣王莊沙區(qū)林場、濟南軍區(qū)黃河三角洲綜合訓練基地、以及山東農(nóng)業(yè)大學林木種質資源基地采集的96份海棠材料進行種質資源分離鑒定以及遺傳多樣性分析,得以從DNA角度對實驗材料進行系統(tǒng)聚類分析并構建指紋圖譜,為后續(xù)的保存海棠種質、避免相同種質的重復收集、新品種的培育進化、規(guī)范海棠市場定名都有重要意義。通過實驗與研究主要得到以下結果:1.對影響海棠SSR反應體系的五個主要因素進行了不同水平的優(yōu)化實驗,最終確立了海棠分子標記的反應體系為20μL:10μM前后引物各0.15μL,1μLDNA原液,10ng/μLDNA模板,0.5UTaqDNA聚合酶0.2μL,200μmol/L dNTP1.6μL,2.0 mmol/LMg Cl22μL,用重蒸水調整體系終體積為20μL。Touchdown PCR擴增程序為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s;Tm℃(引物各異),復性30 s;72℃延伸30s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。4℃低溫保存。2.從40對海棠SSR引物中篩選出18對穩(wěn)定性好、條帶清晰、有良好多態(tài)性的引物用于實驗海棠樣品的遺傳多樣性分析。經(jīng)過毛細管電泳后的數(shù)據(jù)分析,得出18對高多態(tài)性海棠引物共檢出多態(tài)位點數(shù)228個,多態(tài)位點檢出率為80.85%。從同一地點采集的樣品作為同一居群,所有樣品共視為六個居群進行分析得到以下結果:實驗海棠材料的平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.8085,平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.1544,平均Nei遺傳多樣指數(shù)(H)為0.1099,平均Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.1920,總基因多樣性(Ht)平均值為0.1179,平均基因分化系數(shù)(Gst)0.2696。綜合分析海棠有較高的遺傳多樣性。3.通過結合遺傳系數(shù),配合海棠新品種的相關性狀,對96份海棠樣品材料進行聚類分析,在遺傳系數(shù)處0.79-0.82處,分為了甜茶組、新雜交培育組、冬紅果組、山荊子組、沙果組、西府海棠組、湖北海棠組。并將新雜交培育組、山荊子組、沙果組根據(jù)親緣關系遠近分別又分成了6、2、4個小組,以對采集海棠材料里的新培育品種進行親緣關系遠近區(qū)分。4.通過實驗的擴增結果,分析96個樣品,得到采集樣品實際為88份海棠種質材料。在此基礎上,對篩選出的18對高多態(tài)性擴增引物結合88份種質構建了海棠的指紋圖譜。其中僅CH02d08/Z71981/CH01c06/HI02F06/CH03G12這五個引物的組合鑒別效率就達到了全部種質的86%,即通過5對引物就可以對76份海棠種質進行種質分離鑒別。在下一步的研究中可以作為優(yōu)選引物進行實驗。另有8份種質未能檢測出差異,是否為相同種質或是未檢出差異還需進一步研究驗證。
【學位單位】:山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:S661.4
【部分圖文】:

海棠,材料,反應體系,后海


圖 3-1 25-48 號海棠材料 DNA 檢測圖Figure 3-1 The results of DNAelectrophoresis of No.25-No.48 Malus materials圖 3-2 49-72 號海棠材料 DNA 檢測圖Figure 3-2 The results of DNAelectrophoresis of No.49-No.72 Malus materials 優(yōu)化海棠 SSR 反應體系1 熒光引物 PCR 擴增體系經(jīng)過實驗不斷優(yōu)化,得到如表 3-1 海棠 PCR 反應體系表 3-1 優(yōu)化后海棠 PCR 反應體系組成Table3-1 Reaction system of Malus PCR after optimization

海棠,材料,種質資源,質量


基于 SSR 分子標記的海棠種質資源分離與鑒定果與分析 DNA 濃度純度檢測檢測 DNA 質量時采用了瓊脂糖凝膠電泳法。瓊脂糖跑膠結果如圖,條帶清晰說明 DNA 提取質量較好,也可用于 PCR 擴增反應的驗證。圖 3-1 25-48 號海棠材料 DNA 檢測圖Figure 3-1 The results of DNAelectrophoresis of No.25-No.48 Malus materials

海棠,檢驗結果,引物,位點


圖 3-3 引物 GD100 對 37-60 號海棠材料的擴增檢驗結果Figure 3-3 Amplification test result of primer GD100 for No. 37-No.60 Malus materialFigure 3-4 引物 Hi02f0OO6 對 37-60 號海棠材料的擴增檢驗結果圖 3-4 Amplification test result of primer Hi02f0OO6 for No. 37- No.60 Malus material細管電泳結果例分析:圖 3-5 為 7 號樣品在 CH2B12 位點的毛細管電泳峰值圖,顯示檢雜亂,但該樣品在其他位點,如圖 3-6 在位點 NZ28f04 的峰值較為明顯,以圖 3-5 中除兩最高峰外其他視為無效峰。
【參考文獻】

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本文編號:2878932

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