發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 22:36

　　 中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙屬植物,我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一。但中國(guó)水仙根為肉質(zhì)須根,生長(zhǎng)發(fā)育期需水量大,且可用于栽種水仙的良田大幅減少,因此,研究中國(guó)水仙應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿等逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程,對(duì)拓寬水仙用途,擴(kuò)大其栽種地域具有重要意義。本研究主要分為三個(gè)部分:第一部分為'云香'水仙非生物脅迫相關(guān)WRKY基因的克隆;第二部分主要檢測(cè)'云香'水仙WRKY基因的組織特異性表達(dá)、時(shí)空特異性表達(dá)以及外源植物激素處理、非生物脅迫處理后的表達(dá)特征;第三部分為'云香'水仙WRKY基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱和抗鹽能力初步分析。本研究結(jié)果為選育抗逆性的水仙新品種提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.本研究基于課題組前期對(duì)'云香'水仙不同花期花瓣和副冠的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),利用RT-PCR技術(shù)克隆了NtWRKYY1(GenBank登錄號(hào)為 KX056495)和 NtWRKYY2(GenBank 登錄號(hào)為 KX056496)基因,對(duì)其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析。氨基酸基本理化性質(zhì)分析表明NtWRKYY1蛋白為酸性且不穩(wěn)定的疏水性蛋白,NtWRKYY2蛋白為堿性且不穩(wěn)定的親水性蛋白。這2個(gè)蛋白為非分泌蛋白和非跨膜蛋白,以絲氨酸修飾為主導(dǎo)、蘇氨酸或酪氨酸為輔的磷酸化修飾方式。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明這2個(gè)蛋白定位在細(xì)胞核的可能性較大。序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明NtWRKYY1基因?qū)儆冖騝類WRKY轉(zhuǎn)錄因子,NtWRKYY2基因?qū)儆冖騞類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因在'云香'水仙花中表達(dá)量顯著高于根和葉,具有明顯的組織特異性;時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果表明在開(kāi)花過(guò)程中的花瓣和副冠上NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的轉(zhuǎn)錄水平基本呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì),推測(cè)NtWRKYY1和NtWRKYY2基因可能參與'云香'水仙花朵衰老的過(guò)程;外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)處理'云香'水仙葉片后的表達(dá)特性表明NtWRKYY1基因的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)和MeJA抑制,而NtWRKYY2基因的表達(dá)受ABA、MeJA誘導(dǎo);非生物脅迫處理'云香'水仙葉片后的表達(dá)特性表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的表達(dá)可能受高溫、干旱、鹽的誘導(dǎo)。3.利用In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建了 pMDC140-NtWRKYY1和pMDC140-NtWRKYY2過(guò)表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)PCR和GUS染色鑒定證明WRKY基因已經(jīng)導(dǎo)入煙草基因組中,分別獲得了轉(zhuǎn)NtWRKYY1基因煙草T0代陽(yáng)性苗3株,轉(zhuǎn)NtWRKYY2基因煙草T0代陽(yáng)性苗8株,收獲T0代陽(yáng)性苗種子后播種獲得T1代陽(yáng)性苗,對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理,結(jié)果顯示,NtWRKY11和NtWRKYY2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草葉片萎蔫與黃化程度明顯小于野生型煙草,研究表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草具有抵抗干旱和鹽脅迫的能力。該研究為水仙抗旱和抗鹽轉(zhuǎn)基因育種提供備選目的基因,為進(jìn)一步篩選WRKY候選基因轉(zhuǎn)化水仙,以培育抗旱和抗鹽性強(qiáng),適應(yīng)性廣的中國(guó)水仙新品種奠定工作基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S682.21
【部分圖文】：

３結(jié)果與分析??３．１?‘云香’水仙花瓣ＲＮＡ提取的質(zhì)量??‘云香’水仙花瓣提取的ＲＮＡ，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示（圖２－１），??出現(xiàn)２８Ｓ、１８Ｓ兩條明顯的條帶，且２８ＳＲＮＡ亮度約為１８ＳＲＮＡ的２倍，整體??條帶清晰整齊，無(wú)ＤＮＡ污染，無(wú)拖尾彌散現(xiàn)象，這表明所提取的ＲＮＡ未發(fā)生??降解，具有較好的完整性。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，樣品ＲＮＡ的ＯＤ２６０ｍＷ２８０ｎｍ??介于１．８－２．０之間，ＯＤ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ均大于２．０，這表明所提取的ＲＮＡ無(wú)蛋白質(zhì)、??其他有機(jī)物、其他小分子物質(zhì)的污染

?葡恪??桑祝遙耍倩?虻目寺〖吧?鐨畔⒀Х治觶崳?３．２?‘云香’水仙ＭｔＳＴ基因的克隆與序列分析??ＰＣＲ結(jié)果（圖２－２）顯示，以‘云香’水仙盛花期花瓣ＲＮＡ逆轉(zhuǎn)錄成的??ｃＤＮＡ為模板，用特異引物進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與預(yù)期基因片段大??小一致。測(cè)序結(jié)果表明，２條基因的開(kāi)放閱讀框（ＯＲＦ）分別為５１０ｂｐ、８６７ｂｐ，??共編碼１６９、２８９個(gè)氨基酸，將２個(gè)基因依次命名為ＭＰｍｒｍ、??ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號(hào)分別為?ＫＸ０５６４９５、ＫＸ０５６４９６。??Ｍ．?ＤＬ２０００；?ｌ．ＮｔＷＲＫＹＹｌ－，?２．ＭＷＲＫＹＹ２；??圖２－２?‘云香’水仙ＮｔＷＲＫＹＹ?１、ＮｔＷＲＫＹＹ２基因的克隆??Ｆｉｇ．?２－２?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＮｔＷＲＫＹＹｌ?？ｉｎｄＮｔＷＲＫＹＹ２?ｇｅｎｅｓ?ｆｒｏｍ?Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ?ｔａｚｅｔｔａ?ｖａｒ．?＇Ｙｕｎｘｉａｎｇ５??３．３?‘云香’水仙ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)分析??３．３．１氨基酸基本理化性質(zhì)分析??氨基酸基本理化性質(zhì)分析結(jié)果表明（表２－７），ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白和??ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)以??及疏水性均各不相同，說(shuō)明這２個(gè)蛋白可能具有不同的功能。ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白??的等電點(diǎn)小于７．００，不穩(wěn)定系數(shù)大于４０，疏水性為正值，說(shuō)明該蛋白為酸性且??不穩(wěn)定的疏水性蛋白。ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的等電點(diǎn)大于７．００

第二章‘云香’水仙ＷＲＫＹ基因的克隆及生物信息學(xué)分析??ＷＲＫＹＧＱＫ基序，Ｃ端鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)椋茫�４Ｃｘ２３ＨｘＨ型，是ＩＩ類ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子。??利用ＭＥＧＡ５．２軟件構(gòu)建了ＮｔＷＲＫＹＹｌ與擬南芥中＾類ＷＲＫＹ轉(zhuǎn)錄因子的蛋??白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示（圖２－８）?ＮｔＷＲＫＹＹｌ與ＡｔＷＲＫＹ５７聚在一起，進(jìn)一??步說(shuō)明基因?qū)儆冢桑?ｃ類ｗｒｋｙ轉(zhuǎn)錄因子。??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李歡;何炎森;李科;申艷紅;吳用;陳曉靜;;多花水仙WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆與序列分析[J];熱帶作物學(xué)報(bào);2014年12期

2 王娜;張振葆;黃鳳珠;李洪有;張素芝;;WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物脅迫應(yīng)答的研究進(jìn)展[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2014年10期

3 ZHANG XiaoFeng;JIANG Tao;YU YongTao;WU Zhen;JIANG ShangChuan;LU Kai;FENG XiuJing;LIANG Shan;LU YanFen;WANG XiaoFang;ZHANG DaPeng;;Arabidopsis co-chaperonin CPN20 antagonizes Mg-chelatase H subunit to derepress ABA-responsive WRKY40 transcription repressor[J];Science China(Life Sciences);2014年01期

4 邱珊蓮;林江波;王偉英;鄒暉;鄭開(kāi)斌;;漳州水仙花產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J];福建農(nóng)業(yè)科技;2013年10期

5 趙莉;鐘鳴;馬慧;李浩戈;陳麗靜;鐘聲;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年03期

6 苗鴻鷹;趙金峰;李小娟;孫昭華;路文靜;谷俊濤;郭程瑾;肖凱;;轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY72b-1的克隆、表達(dá)及在煙草中表達(dá)對(duì)植株磷效率的影響[J];作物學(xué)報(bào);2009年11期

7 余迪求;陳利鋼;張利平;;轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY超級(jí)家族:起源、結(jié)構(gòu)和功能[J];云南植物研究;2006年01期

8 陳曉靜;福建3個(gè)產(chǎn)地水仙的核型分析[J];植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào);2004年04期

9 楊成麗,劉樹(shù)楠,周吉源,劉德立;高效煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及甜蛋白基因的導(dǎo)入[J];生物技術(shù);2004年02期

10 郭尚璜;龍海縣水仙花高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J];福建熱作科技;1991年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 趙瀟俐;多花水仙離體快繁技術(shù)研究及WD40基因表達(dá)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

2 華靜靜;‘黃花水仙2號(hào)’三個(gè)WD40相關(guān)基因克隆及表達(dá)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

3 林琳;漳州水仙花產(chǎn)業(yè)調(diào)查[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

4 葉一江;多花水仙類胡蘿卜素生物合成途徑部分酶基因的克隆與分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

5 莊曉英;中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化及離體誘變體系的研究[D];浙江大學(xué);2005年

6 蔡文燕;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)人乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)化中國(guó)水仙的初步研究[D];福建師范大學(xué);2005年

7 曾榮華;中國(guó)水仙轉(zhuǎn)IPT基因的研究[D];廈門(mén)大學(xué);2001年

本文編號(hào)：2893704