發(fā)布時間：2020-11-22 10:04

　　 番茄(Solanum lycopersicum)是重要的經(jīng)濟(jì)作物。在我國栽培面積廣泛,因其營養(yǎng)價值高、物美價廉而被人們所喜愛。但在其開花結(jié)果期常因外界不適宜的環(huán)境,如高溫、低溫、干旱等,而造成花粉授粉不良、落花落果,從而影響番茄的產(chǎn)量。影響花粉發(fā)育的因素有多種,如環(huán)境條件、激素、營養(yǎng)供給等。近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)花粉發(fā)育是受多種基因調(diào)控的一個復(fù)雜過程。IDA(INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION)最早被認(rèn)為是一種調(diào)控擬南芥花器官脫落的信號肽。課題組前期發(fā)現(xiàn)SlIDA在番茄中調(diào)控脫落并不明顯,本研究發(fā)現(xiàn)SlIDA在雄蕊中的表達(dá)量很高,且對ProSlIDA::GUS轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行GUS染色時發(fā)現(xiàn),雄蕊及其花粉中有表達(dá)。并結(jié)合前期獲得的SlIDA RNAi沉默植株,分析了SlIDA在番茄花粉發(fā)育中的功能,其結(jié)果如下:1.番茄SlIDA基因時空表達(dá)特征分析顯示,SlIDA基因主要在番茄花器官的雄蕊中表達(dá)。2.構(gòu)建ProSlIDA::GUS轉(zhuǎn)基因番茄,組織器官染色結(jié)果顯示,SlIDA主要在雄蕊的花粉中表達(dá)。3.篩選T5代SlIDA沉默轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)RNAi株系結(jié)實率和結(jié)子率顯著降低,即使極個別RNAi株系結(jié)果,也是畸形果,且種子極少。這說明SlIDA影響了植株的坐果率和結(jié)籽率,雜交結(jié)果顯示,RNAi植株主要影響了花粉的授粉受精。4.SlIDA RNAi株系花粉�；�形,雄蕊不開裂,花粉活力和花粉萌發(fā)率顯著低于野生型,這說明SlIDA影響了花粉發(fā)育。5.NBT和DAB染色檢測SlIDA RNAi沉默轉(zhuǎn)基因植株花粉發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)雄蕊ROS的積累量較野生型顯著降低。以上這些結(jié)果表明,在番茄中SlIDA通過參與花粉發(fā)育從而影響番茄的坐果率和結(jié)籽率,進(jìn)而影響了番茄產(chǎn)量。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

圖 1 花器官脫落的網(wǎng)絡(luò)模式圖（引自 Bin Liu et al., 2013）Fig.1 Model for networks controlling floral organ abscission (Cited from Bin Liu et al., 2013)1.1.2 IDA 與側(cè)根發(fā)育的研究側(cè)根的產(chǎn)生與脫落過程一樣，可以分為不同的階段。首個發(fā)現(xiàn)側(cè)根原基起始于中柱鞘細(xì)胞的學(xué)者將擬南芥?zhèn)雀�的發(fā)生過程分為八個階段（Malamy and Benfey, 1997）：I，建成細(xì)胞垂周分裂階段；II，兩細(xì)胞層的側(cè)根原基階段；III，三細(xì)胞層的側(cè)根原基階段；IV，四細(xì)胞層的側(cè)根原基階段；V，內(nèi)皮層側(cè)根原基階段；VI，皮層側(cè)根原基階段；VII，接近突破表皮的側(cè)根原基階段；VIII，側(cè)根露出表皮伸長階段。這是目前最普遍、最容易接受的一種劃分方式（劉大同等, 2013）。側(cè)根發(fā)生過程必須經(jīng)過內(nèi)皮層、皮層和表皮細(xì)胞（Malamy and Benfey, 1997）。側(cè)根的出現(xiàn)就像器官脫落一樣，需要溶解相鄰細(xì)胞的中間層。細(xì)胞壁水解（CWR）候選基因的定量表達(dá)被用來分析 IDA 信號如何影響側(cè)根發(fā)生過程中 CWR 基因的表達(dá)。對于 XTH 和 EXP 基因家族成員，比如 XTH23/XTR6 和 EXP17（Laskowski et al., 2006; Gonzalez-Carranza et al., 2007; 2012; Swarup et al., 2008）在側(cè)根原基表達(dá)，在 hae hsl2 雙突變體而不是 hae 或 hsl2 單突變體中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（Kumpf et al., 2013）。然而，PG 家族的兩個基因 PGLR 和 PGAZAT/ADPG2（Swarupet al.,

2 IDA-HAE/HSL2 信號調(diào)控側(cè)根發(fā)生模式圖（引自 Kumpf et al., 2013l of IDA-HAE/HSL2 signaling regulates LR emergence (Cited from Kump長素的相關(guān)研究累在側(cè)根原基（LRPs）的中央細(xì)胞，之后積累在 LRP 的頂端，一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Peret et al., 2009）。假設(shè)生長素從側(cè)根原在皮層中會誘導(dǎo)生長素內(nèi)流載體 LIKE AUX1-3（LAX3）的表素進(jìn)一步導(dǎo)入到皮層和表皮細(xì)胞層。在這些組織里，由生OOT1（SLR1）/IAA14 的降解釋放 AUXIN RESPONSE FACTO錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞壁水解（CWR）基因的表達(dá)，如 EXP17、 et al., 2006; Swarup et al., 2008）。過程中，IDA 的表達(dá)依賴于生長素。證據(jù)來源于對 IDAS）在皮層和表皮細(xì)胞通過外施 IAA 或 NAA（1 μM）被激活的 IAA 之后的 6-24 h IDA 的表達(dá)水平增加 100 倍以上。在 arf水平被降低；而在 arf7 突變體中正常 IDA 感應(yīng)被完全消除 ARF7 的下游（Kumpf et al., 2013）。但是沒有證據(jù)說明 IDA并且生長素對 IDA 表達(dá)水平的影響可能是間接的。HAE 和 H

IDA::GUS 表達(dá)載體的構(gòu)建 利用軟件分析 SlIDA 啟動子序列中的限制性，pBGWFS7.0 雙元表達(dá)載體有多個克隆位點，選擇合適的限制性內(nèi)切不能切割目的片段，并在引物 5'末端添加酶切位點。引物為A-pro-F1：5'-TTTAACCATCTGATATCCGATTCT-3'，A-pro-R2：5'-ATGAAAGGATTATATTTTCTTGAATTTT-3'。以稀釋 100 倍的質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR，按照純化試劑盒說明書將 PCR對純化后的 TA 克隆重組質(zhì)粒 SlIDA-pro-T 及載體 pBGWFS7.0 質(zhì)粒 P酶切反應(yīng)體系如下：表 5 酶切反應(yīng)體系Table 5 Enzymereaction system組成成分Components體積VolumeSlIDA-pro-T 1 μLBamH 1 μLNco 1 1 μL10×Reaction Buffer 2 μLRNase-free 15 μLTotal 20 μL
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本文編號：2894530