應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)篩選柿DkPDC2互作轉(zhuǎn)錄因子的研究
發(fā)布時間：2020-12-05 22:30
完全甜柿自然脫澀存在兩種機理,分別為“稀釋效應(yīng)”和“凝固效應(yīng)”。日本原產(chǎn)完全甜柿（日本甜柿）以“稀釋效應(yīng)”為主,而中國原產(chǎn)完全甜柿（中國甜柿）既有“稀釋效應(yīng)”又有“凝固效應(yīng)”,而“凝固效應(yīng)”可能在中國甜柿自然脫澀中具有更重要的作用。已有研究表明,DkPDC2是乙醛代謝途徑中的關(guān)鍵基因,而乙醛與可溶性單寧結(jié)合形成不溶性單寧,但其調(diào)控機制尚不完全清楚。本試驗以中國甜柿‘羅田甜柿’為研究試材,通過酵母單雜交cDNA文庫篩選和互作分析,以期獲得調(diào)控DkPDC2的轉(zhuǎn)錄因子與其影響中國甜柿自然脫澀的分子機制。主要研究結(jié)果如下。1.通過酵母文庫篩選獲得候選轉(zhuǎn)錄因子,將其命名為DkMYB9。通過酵母單雜試驗和雙熒光素酶試驗,驗證候選轉(zhuǎn)錄因子DkMYB9可以激活DkPDC2啟動子活性,表明DkMYB9與DkPDC2存在相互作用。2.聚類分析發(fā)現(xiàn)候選轉(zhuǎn)錄因子DkMYB9與擬南芥MYB家族中具有抑制花青素合成功能的AtMYB3和AtMYB4等聚為一類;氨基酸序列比對分析,結(jié)果顯示候選轉(zhuǎn)錄因子DkMYB9具有R2R3結(jié)構(gòu)域和MYB-bHLH相互結(jié)合基序。不同脫澀類型柿品種中DkMYB9和DkPDC2表達(dá)模式分...
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同脫澀類型柿品種分類（根據(jù)Akagietal.2011，有修改）
圖 2 乙醛代謝途徑（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）從中國甜柿分離出 ADH 和 PDC 基因家族成員。通過柿，發(fā)現(xiàn) DkPDC2 參與調(diào)控中國甜柿自然脫澀，且比 DkADH1 更能促進(jìn)自然凝固。李慧（2016）通過染色體步移技術(shù)，獲得不同柿脫澀類型中PDC 啟動子序列，并對 DkPDC 啟動子序列比較分析，發(fā)現(xiàn)在中國甜柿和‘羅田甜柿’品種中，DkPDC2 啟動子序列高度一致，但是與日本甜柿相比較，啟動子序列存在明顯差異，即起始位點-372 bp– -363 b國甜柿品種中堿基序列為 TTTTG-ATT，日本甜柿‘陽豐’為 TTTTT盤柿’這一位點的序列缺失，推測可能由于不同脫澀類型柿品種在這序列導(dǎo)致其脫澀機理的不同。并以中國甜柿‘羅田甜柿’為材料，構(gòu)均一化 cDNA 酵母文庫。為后續(xù)篩選 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通過與互作進(jìn)一步參與中國甜柿自然脫澀過程，并從酵母 cDNA 文庫中篩選到1 互作的轉(zhuǎn)錄因子。
6圖 3 酵母雙雜交技術(shù)的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)術(shù)現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前體細(xì)胞中獲得 OLF-1 轉(zhuǎn)錄因子的 cDNA。隨子在植物上的調(diào)控。尤其在植物代謝和調(diào)控機理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的啟動子為誘餌，通過酵錄因子，并通過煙草瞬時轉(zhuǎn)化和 EMSA 實驗，最終動子區(qū)域。Li等（2017）通過酵母單雜交實驗，說明CB9B2 響應(yīng)非生物脅迫的必要條件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程[J]. 趙文軍,張迪,馬麗娟,柴友榮. 植物生理學(xué)通訊. 2009(05)
[2]酵母單雜交系統(tǒng)在植物基因工程研究中的應(yīng)用[J]. 王琪,朱延明,王冬冬. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2008(01)
[3]煙草DREBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DRE元件的關(guān)鍵氨基酸[J]. 劉衛(wèi)群,王永亮,郭紅祥,趙同金,周海夢,郭藹光. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2006(02)
[4]酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 張迪,霍克克,顧科隆,趙翔,李育陽. 高技術(shù)通訊. 2000(03)
[5]甘、澀柿果實主要化學(xué)成份的研究[J]. 費學(xué)謙,王勁風(fēng),周立紅,龔榜初,吳開云. 林業(yè)科學(xué)研究. 1994(01)
博士論文
[1]中國甜柿cDNA-SSAP文庫構(gòu)建及自然脫澀相關(guān)基因功能驗證[D]. 關(guān)長飛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀機理研究[D]. 王燕.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
碩士論文
[1]羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母雜交cDNA文庫構(gòu)建及DkPDC2啟動子文庫篩選[D]. 李慧.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]與柿單寧自然凝固相關(guān)的ALDH2基因家族克隆與表達(dá)分析[D]. 丁金鴿.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]中國原產(chǎn)完全甜柿‘鄂柿1號’自然脫澀特點研究[D]. 陳道明.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
本文編號：2900197
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同脫澀類型柿品種分類（根據(jù)Akagietal.2011，有修改）
圖 2 乙醛代謝途徑（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）從中國甜柿分離出 ADH 和 PDC 基因家族成員。通過柿，發(fā)現(xiàn) DkPDC2 參與調(diào)控中國甜柿自然脫澀，且比 DkADH1 更能促進(jìn)自然凝固。李慧（2016）通過染色體步移技術(shù)，獲得不同柿脫澀類型中PDC 啟動子序列，并對 DkPDC 啟動子序列比較分析，發(fā)現(xiàn)在中國甜柿和‘羅田甜柿’品種中，DkPDC2 啟動子序列高度一致，但是與日本甜柿相比較，啟動子序列存在明顯差異，即起始位點-372 bp– -363 b國甜柿品種中堿基序列為 TTTTG-ATT，日本甜柿‘陽豐’為 TTTTT盤柿’這一位點的序列缺失，推測可能由于不同脫澀類型柿品種在這序列導(dǎo)致其脫澀機理的不同。并以中國甜柿‘羅田甜柿’為材料，構(gòu)均一化 cDNA 酵母文庫。為后續(xù)篩選 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通過與互作進(jìn)一步參與中國甜柿自然脫澀過程，并從酵母 cDNA 文庫中篩選到1 互作的轉(zhuǎn)錄因子。
6圖 3 酵母雙雜交技術(shù)的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)術(shù)現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前體細(xì)胞中獲得 OLF-1 轉(zhuǎn)錄因子的 cDNA。隨子在植物上的調(diào)控。尤其在植物代謝和調(diào)控機理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的啟動子為誘餌，通過酵錄因子，并通過煙草瞬時轉(zhuǎn)化和 EMSA 實驗，最終動子區(qū)域。Li等（2017）通過酵母單雜交實驗，說明CB9B2 響應(yīng)非生物脅迫的必要條件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程[J]. 趙文軍,張迪,馬麗娟,柴友榮. 植物生理學(xué)通訊. 2009(05)
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[3]煙草DREBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DRE元件的關(guān)鍵氨基酸[J]. 劉衛(wèi)群,王永亮,郭紅祥,趙同金,周海夢,郭藹光. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2006(02)
[4]酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 張迪,霍克克,顧科隆,趙翔,李育陽. 高技術(shù)通訊. 2000(03)
[5]甘、澀柿果實主要化學(xué)成份的研究[J]. 費學(xué)謙,王勁風(fēng),周立紅,龔榜初,吳開云. 林業(yè)科學(xué)研究. 1994(01)
博士論文
[1]中國甜柿cDNA-SSAP文庫構(gòu)建及自然脫澀相關(guān)基因功能驗證[D]. 關(guān)長飛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀機理研究[D]. 王燕.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
碩士論文
[1]羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母雜交cDNA文庫構(gòu)建及DkPDC2啟動子文庫篩選[D]. 李慧.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]與柿單寧自然凝固相關(guān)的ALDH2基因家族克隆與表達(dá)分析[D]. 丁金鴿.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]中國原產(chǎn)完全甜柿‘鄂柿1號’自然脫澀特點研究[D]. 陳道明.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
本文編號：2900197
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