應用酵母單雜交技術篩選柿DkPDC2互作轉錄因子的研究
發(fā)布時間：2020-12-05 22:30
完全甜柿自然脫澀存在兩種機理,分別為“稀釋效應”和“凝固效應”。日本原產(chǎn)完全甜柿（日本甜柿）以“稀釋效應”為主,而中國原產(chǎn)完全甜柿（中國甜柿）既有“稀釋效應”又有“凝固效應”,而“凝固效應”可能在中國甜柿自然脫澀中具有更重要的作用。已有研究表明,DkPDC2是乙醛代謝途徑中的關鍵基因,而乙醛與可溶性單寧結合形成不溶性單寧,但其調(diào)控機制尚不完全清楚。本試驗以中國甜柿‘羅田甜柿’為研究試材,通過酵母單雜交cDNA文庫篩選和互作分析,以期獲得調(diào)控DkPDC2的轉錄因子與其影響中國甜柿自然脫澀的分子機制。主要研究結果如下。1.通過酵母文庫篩選獲得候選轉錄因子,將其命名為DkMYB9。通過酵母單雜試驗和雙熒光素酶試驗,驗證候選轉錄因子DkMYB9可以激活DkPDC2啟動子活性,表明DkMYB9與DkPDC2存在相互作用。2.聚類分析發(fā)現(xiàn)候選轉錄因子DkMYB9與擬南芥MYB家族中具有抑制花青素合成功能的AtMYB3和AtMYB4等聚為一類;氨基酸序列比對分析,結果顯示候選轉錄因子DkMYB9具有R2R3結構域和MYB-bHLH相互結合基序。不同脫澀類型柿品種中DkMYB9和DkPDC2表達模式分...
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同脫澀類型柿品種分類（根據(jù)Akagietal.2011，有修改）
圖 2 乙醛代謝途徑（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）從中國甜柿分離出 ADH 和 PDC 基因家族成員。通過柿，發(fā)現(xiàn) DkPDC2 參與調(diào)控中國甜柿自然脫澀，且比 DkADH1 更能促進自然凝固。李慧（2016）通過染色體步移技術，獲得不同柿脫澀類型中PDC 啟動子序列，并對 DkPDC 啟動子序列比較分析，發(fā)現(xiàn)在中國甜柿和‘羅田甜柿’品種中，DkPDC2 啟動子序列高度一致，但是與日本甜柿相比較，啟動子序列存在明顯差異，即起始位點-372 bp– -363 b國甜柿品種中堿基序列為 TTTTG-ATT，日本甜柿‘陽豐’為 TTTTT盤柿’這一位點的序列缺失，推測可能由于不同脫澀類型柿品種在這序列導致其脫澀機理的不同。并以中國甜柿‘羅田甜柿’為材料，構均一化 cDNA 酵母文庫。為后續(xù)篩選 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通過與互作進一步參與中國甜柿自然脫澀過程，并從酵母 cDNA 文庫中篩選到1 互作的轉錄因子。
6圖 3 酵母雙雜交技術的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)術現(xiàn)在被廣泛應用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前體細胞中獲得 OLF-1 轉錄因子的 cDNA。隨子在植物上的調(diào)控。尤其在植物代謝和調(diào)控機理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的啟動子為誘餌，通過酵錄因子，并通過煙草瞬時轉化和 EMSA 實驗，最終動子區(qū)域。Li等（2017）通過酵母單雜交實驗，說明CB9B2 響應非生物脅迫的必要條件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【參考文獻】：
期刊論文
[1]原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程[J]. 趙文軍,張迪,馬麗娟,柴友榮. 植物生理學通訊. 2009(05)
[2]酵母單雜交系統(tǒng)在植物基因工程研究中的應用[J]. 王琪,朱延明,王冬冬. 北京林業(yè)大學學報. 2008(01)
[3]煙草DREBP轉錄因子結合DRE元件的關鍵氨基酸[J]. 劉衛(wèi)群,王永亮,郭紅祥,趙同金,周海夢,郭藹光. 中國生物化學與分子生物學報. 2006(02)
[4]酵母雙雜交技術研究進展[J]. 張迪,霍克克,顧科隆,趙翔,李育陽. 高技術通訊. 2000(03)
[5]甘、澀柿果實主要化學成份的研究[J]. 費學謙,王勁風,周立紅,龔榜初,吳開云. 林業(yè)科學研究. 1994(01)
博士論文
[1]中國甜柿cDNA-SSAP文庫構建及自然脫澀相關基因功能驗證[D]. 關長飛.華中農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀機理研究[D]. 王燕.華中農(nóng)業(yè)大學 2010
碩士論文
[1]羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母雜交cDNA文庫構建及DkPDC2啟動子文庫篩選[D]. 李慧.華中農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]與柿單寧自然凝固相關的ALDH2基因家族克隆與表達分析[D]. 丁金鴿.華中農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]中國原產(chǎn)完全甜柿‘鄂柿1號’自然脫澀特點研究[D]. 陳道明.華中農(nóng)業(yè)大學 2008
本文編號：2900197
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：61 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同脫澀類型柿品種分類（根據(jù)Akagietal.2011，有修改）
圖 2 乙醛代謝途徑（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）從中國甜柿分離出 ADH 和 PDC 基因家族成員。通過柿，發(fā)現(xiàn) DkPDC2 參與調(diào)控中國甜柿自然脫澀，且比 DkADH1 更能促進自然凝固。李慧（2016）通過染色體步移技術，獲得不同柿脫澀類型中PDC 啟動子序列，并對 DkPDC 啟動子序列比較分析，發(fā)現(xiàn)在中國甜柿和‘羅田甜柿’品種中，DkPDC2 啟動子序列高度一致，但是與日本甜柿相比較，啟動子序列存在明顯差異，即起始位點-372 bp– -363 b國甜柿品種中堿基序列為 TTTTG-ATT，日本甜柿‘陽豐’為 TTTTT盤柿’這一位點的序列缺失，推測可能由于不同脫澀類型柿品種在這序列導致其脫澀機理的不同。并以中國甜柿‘羅田甜柿’為材料，構均一化 cDNA 酵母文庫。為后續(xù)篩選 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通過與互作進一步參與中國甜柿自然脫澀過程，并從酵母 cDNA 文庫中篩選到1 互作的轉錄因子。
6圖 3 酵母雙雜交技術的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)術現(xiàn)在被廣泛應用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前體細胞中獲得 OLF-1 轉錄因子的 cDNA。隨子在植物上的調(diào)控。尤其在植物代謝和調(diào)控機理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的啟動子為誘餌，通過酵錄因子，并通過煙草瞬時轉化和 EMSA 實驗，最終動子區(qū)域。Li等（2017）通過酵母單雜交實驗，說明CB9B2 響應非生物脅迫的必要條件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【參考文獻】：
期刊論文
[1]原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程[J]. 趙文軍,張迪,馬麗娟,柴友榮. 植物生理學通訊. 2009(05)
[2]酵母單雜交系統(tǒng)在植物基因工程研究中的應用[J]. 王琪,朱延明,王冬冬. 北京林業(yè)大學學報. 2008(01)
[3]煙草DREBP轉錄因子結合DRE元件的關鍵氨基酸[J]. 劉衛(wèi)群,王永亮,郭紅祥,趙同金,周海夢,郭藹光. 中國生物化學與分子生物學報. 2006(02)
[4]酵母雙雜交技術研究進展[J]. 張迪,霍克克,顧科隆,趙翔,李育陽. 高技術通訊. 2000(03)
[5]甘、澀柿果實主要化學成份的研究[J]. 費學謙,王勁風,周立紅,龔榜初,吳開云. 林業(yè)科學研究. 1994(01)
博士論文
[1]中國甜柿cDNA-SSAP文庫構建及自然脫澀相關基因功能驗證[D]. 關長飛.華中農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀機理研究[D]. 王燕.華中農(nóng)業(yè)大學 2010
碩士論文
[1]羅田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母雜交cDNA文庫構建及DkPDC2啟動子文庫篩選[D]. 李慧.華中農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]與柿單寧自然凝固相關的ALDH2基因家族克隆與表達分析[D]. 丁金鴿.華中農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]中國原產(chǎn)完全甜柿‘鄂柿1號’自然脫澀特點研究[D]. 陳道明.華中農(nóng)業(yè)大學 2008
本文編號：2900197
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