發(fā)布時間：2020-11-03 18:16

　　 鹽脅迫是全球范圍內影響農作物產量的重要非生物脅迫因子之一。代謝組學是分析生物體受外界刺激、病菌侵染和遺傳信息改變等因素引起代謝變化的一門學科,由于可直觀了解植物體內代謝產物動態(tài)變化,故而在植物應對脅迫響應研究中應用廣泛,是植物抗逆性研究的重要手段。本研究以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為實驗材料,利用NaCl溶液對擬南芥植株進行脅迫處理,采用中性解吸電噴霧萃取電離質譜(Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry,ND-EESI-MS)、超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜聯用(Ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)和高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)三種代謝組學技術分析了擬南芥在鹽脅迫下的代謝產物。主要研究結果如下。1、用50、100、200和300 mM NaCl溶液脅迫處理擬南芥1、4、7 d,采用新興的直接質譜技術ND-EESI-MS對擬南芥蓮座葉進行原位無損分析,正離子模式下獲得了不同脅迫處理擬南芥葉ND-EESI-MS代謝產物指紋圖譜,通過串聯質譜結合有關數據庫,定性出絲氨酸、精氨酸、谷氨酸、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、楊梅素、原兒茶酸、表兒茶素、桑黃素、異戊烯基香豆素和二苯并呋喃12種代謝物。應對鹽脅迫時,絲氨酸、精氨酸、谷氨酸和涉及莽草酸-苯丙素代謝途徑的肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、表兒茶素含量在50、100、200 mM NaCl鹽脅迫下都升高,且在200 mM時變化最大,但在最高濃度300 mM NaCl鹽脅迫下降低。主成分分析(Principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)結果都顯示較高濃度(200 mM和300 mM)鹽脅迫處理組都能很好地與實驗對照組和較低濃度(50mM和100 mM)鹽脅迫處理組區(qū)分。ND-EESI-MS技術無需樣品預處理,可實現對樣品原位活體檢測,并且對樣品不會造成明顯傷害,檢后植物可繼續(xù)生長,可實現對同一株植物的定位持續(xù)觀察,每個樣品檢測時間僅僅為30 s,可以實現高通量快速檢測。ND-EESI-MS分析技術在研究植物活體代謝組學方面具有一定的前景。2、采用UPLC-QTOF-MS非靶向檢測手段分析了200 mM NaCl溶液脅迫下擬南芥葉醇提物,共鑒定出L-苯丙氨酸、脫落酸、蘋果酸、阿魏酸、肉桂酸、蘆丁、半乳糖、尿苷、糖芥子苷等34種化合物。應對鹽脅迫時,擬南芥體內脫落酸積累,L-苯丙氨酸含量顯著降低(p0.05),蘋果酸、原兒茶酸、沒食子酸、山奈酚和蘆丁顯著降低(p0.05),涉及到莽草酸-苯丙素代謝途徑中的肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸和阿魏酸含量也顯著降低,糖代謝中的D-纖維二糖含量顯著升高(p0.05),苷類物質變化不盡相同,尿苷、磷酸鳥苷和蘿卜硫苷含量顯著降低(p0.05),而蕓薹葡萄糖硫苷含量顯著升高(p0.05)。這些物質主要涉及到了氨基酸、莽草酸-苯丙素和糖類等代謝途徑,擬南芥通過這些途徑的一系列變化以響應鹽脅迫。3、采用HPLC結合標準品靶向檢測了200 mM NaCl溶液脅迫下擬南芥葉醇提物中的酚類物質,共檢測到10種酚類物質。與實驗對照組相比,鹽脅迫處理組中原兒茶酸、咖啡酸、蘆丁、肉桂酸和桑黃素含量顯著降低(p0.05),其中肉桂酸含量降低了3倍以上;表兒茶素和(+)-兒茶酸含量顯著升高(p0.05),其中(+)-兒茶酸含量升高了近3倍。顯著性差異較大的7種酚類物質都與植物體內莽草酸-苯丙素代謝過程相關,在擬南芥響應鹽脅迫時起到了關鍵調控作用。本文首先利用新興的直接質譜技術ND-EESI-MS實現對鹽脅迫下擬南芥非靶向代謝組學的快速無損檢測,基于ND-EESI-MS結果,進一步確定200 mM NaCl為處理濃度,采用UPLC-QTOF-MS和HPLC研究了鹽脅迫下擬南芥的代謝產物變化。研究結果在代謝組學層面上揭示鹽脅迫對擬南芥中代謝物的影響,為進一步揭示植物響應鹽脅迫的代謝調控機理提供了理論基礎。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q945.78
【部分圖文】：

第 1 章 引言atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI）[37]、實時直接分析（Directanalysis in real time，DART）[38]，超聲噴霧解吸電離（Desorption sonic sprayionization，DeSSI）[39]、電噴霧萃取電離（Extractive electrospray ionization，EESI）[40]、介質阻擋放電電離（Dielectric barrier discharge ion，DBDI）[41]、低溫等離子體探針（Low-temperature plasma，LTP）[42]、常壓激光解吸電離（An atmosphericpressure laser desorption ionization，APLDI）[43]、內部萃取電噴霧電離質譜（Internalextractive electrospray ionization mass spectrometry，iEESI-MS）[44]和中性解吸-電噴霧萃取電離質譜（ND-EESI-MS）[45]等，已廣泛應用于生命科學、食品安全、環(huán)境分析、醫(yī)學等眾多領域，在人類社會的生產和生活中扮演著越來越重要的角色。這些常壓電離方式的基本原理可以歸納為，首先利用能量源，如光子電子電場加熱等方式，獲得初級離子，然后利用初級離子與原始樣品作用，進而發(fā)生電荷轉移或能量傳遞將待測組分電離，最后進入質譜進行檢測。+++++++++++++++++ +++++++++++++Charged droplets(a) (b)HVDischarge needle

2.1.4 ND-EESI-MS實驗條件圖 2.1 為自行搭建的 ND-EESI-MS 分析原位分析樣品示意圖，選取擬南芥植株上大小均一的蓮座葉葉片，將加工的采樣裝置置于葉片表面，由閥門控制的氮氣直接用作解吸氣，原位分析擬南芥葉子樣品表面組分。實驗各個參數經過優(yōu)化之后進行，分析物在 EESI 環(huán)境中進行離子化，出樣品口和電噴霧束形成一個 60o 的角度（β），兩者之間的距離（a）為 2 mm。電噴霧和 LTQ 儀器離子傳輸管之間角度（α）和樣品出口和 LTQ 儀器離子傳輸管之間角度（γ）都 150o。整個 EESI 裝置和 LTQ 儀器離子傳輸管相平行，和 LTQ 儀器離子入口的距離（b）為 5 mm。EESI 離子源以甲醇：水=1：1（v/v）為萃取劑，萃取溶劑以 2 mL/min的流速通過石英毛細管。在微量進樣針的鋼針部位施加 3.5 kV 正高壓，在電場的作用下，樣品前端產生大量承載待測物的微小帶電液滴，這些微小帶電液滴去溶劑化后得到氣態(tài)待測物離子，引入到質譜儀中進行檢測，質譜儀的掃描范圍為 m/z 50-800。

圖 2.2 鹽脅迫處理組和實驗對照組擬南芥生長情況（鹽脅迫處理組對擬南芥分別施加 50、100、200 和 300 mM NaCl 溶液，鹽脅迫處理 1、4、7 d，實驗對照組為正常澆水處理）Figure 2.2 The growth of A.thaliana in salt stress treatment group and experimental control group(salt stress treatment group applied 50 mM, 100 mM, 200 mM and 300 mM NaCl solution toA.thaliana, salt stress treatment for 1、4、7 d, the experimental control group is normal wateringtreatment)2.2.2鹽脅迫下擬南芥葉中的代謝產物實驗條件經優(yōu)化，如圖 2.1 所示，在正離子模式下，采用新興的直接質譜技術 ND-EESI-MS 直接原位活體檢測擬南芥蓮座葉，獲取不同鹽脅迫條件下擬南芥樣品的所有質譜指紋圖譜信息，每個樣品僅用 30 s 就可從植物葉中獲得如圖2.3 中所示的指紋圖譜信息。以獲得的鹽脅迫 7 d 下擬南芥蓮座葉的一級指紋圖譜為例，利用該方法分別獲得了鹽脅迫 7 d 下在 50 mM、100 mM、200 mM、300mM 的擬南芥葉指紋圖譜信息，從一級指紋圖譜上可以直觀地看到質荷比的變化，這些圖譜有許多共性，如都有 m/z 163、m/z 217、m/z 261、m/z 300、m/z 305、
【參考文獻】

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本文編號：2868926