發(fā)布時間：2020-11-04 03:10

　　 現(xiàn)今,越來越多超級抗藥細(xì)菌的出現(xiàn)對人類的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。面對眾多的多重抗藥致病菌,單靠開發(fā)新藥的傳統(tǒng)方法是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,我們亟需新的策略。因此,近年來人們開始關(guān)注細(xì)菌耐藥性的分子機理,希望以此找到新的突破點。我們前期的研究表明,大腸桿菌(Escherichia coli)YihE激酶是細(xì)胞程序性死亡途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子,在抗生素處理細(xì)菌時能起到保護細(xì)菌的作用。然而,YihE激酶的細(xì)胞通路及其在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控機制尚不清楚。為了了解YihE的具體調(diào)控機制,在本論文工作中我們首先利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選出表達(dá)受yihE突變影響的基因。通過對相關(guān)基因的功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),受yihE突變影響的通路主要有硝酸鹽還原途徑、ED途徑(戊糖磷酸途徑)以及葡萄糖代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)途徑。通過藥敏實驗發(fā)現(xiàn)這些途徑中的narK、gntK、fruK、gntT、edd、narG和ptsG等基因在萘啶酸處理時對細(xì)菌具有保護作用。對于硝酸鹽還原途徑的關(guān)鍵酶NarG的研究表明,硝酸鹽還原酶NarG通過為細(xì)菌藥物外排泵提供質(zhì)子驅(qū)動力而保護細(xì)胞。同時,△yihE突變株中NO水平升高說明YihE對于細(xì)胞的保護作用涉及到硝化應(yīng)激。藥物處理條件下△yihE突變株相對于野生型菌株胞內(nèi)游離鐵水平與ROS水平均上升,表明YihE可能通過控制細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,從而起到對細(xì)菌的保護作用。因此,我們提出YihE的細(xì)胞通路及調(diào)控機制:1)YihE通過磷酸化其靶蛋白,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽代謝,使細(xì)胞內(nèi)活性氮(Reactive Nitrogen species,RNS)水平不至于過高影響到細(xì)胞的存活;2)YihE可能磷酸化DnaK,DnaK負(fù)調(diào)控ED途徑以減少ROS對細(xì)菌的毒害作用,最終避免細(xì)胞死亡。本研究揭示了 YihE激酶的部分通路及其調(diào)控機制,為我們今后針對細(xì)菌自我保護機制開發(fā)藥物,提高現(xiàn)有藥物的殺菌效率提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q932
【部分圖文】：

ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｋｉｎａｓｅ?Ａ?），是一種?Ｓｅｒ／Ｔｈｒ?蛋白激酶（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?）。??ＹｉｈＥ的整體結(jié)構(gòu)是典型的雙葉蛋白激酶，在Ｎ末端區(qū)域具有較小的、主要??是Ｐ－折疊的結(jié)構(gòu)域。在Ｃ－末端區(qū)域具有較大的、主要是ａ－螺旋結(jié)構(gòu)域（圖１－１）。??這兩個結(jié)構(gòu)域通過短的（？１０個殘基）鉸鏈連接，產(chǎn)生開放的裂縫（裂縫１，圖??１－１），其對應(yīng)于所有激酶中的磷酸轉(zhuǎn)移區(qū)。Ｎ末端結(jié)構(gòu)域以８個殘基的環(huán)開始，??接著是螺旋Ａ，其位于由五鏈扭曲的反平行Ｐ－折疊組成的保守的激酶結(jié)構(gòu)之上??（圖１－１）。螺旋Ｂ包圍裂口?１形成口袋，推測是ＡＴＰ結(jié)合位點⑵。這種Ｎ－末端??結(jié)構(gòu)域是真核激酶的典型結(jié)構(gòu)，構(gòu)成所有蛋白激酶中存在的“必需”激酶折疊的??一部分［３］。其余的必需激酶結(jié)構(gòu)在Ｃ末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，它主要由ａ－螺旋組成，可以??細(xì)分為圍繞第二個較大裂隙的兩個裂片（裂隙２，圖１－１）。左葉由四個ａ－螺旋和??一個長發(fā)夾形環(huán)組成

簇的脫水酶，將蛋白結(jié)合鐵釋放到細(xì)胞質(zhì)中形成游離Ｆｅ２＋，然后Ｈ２０２與Ｆｅ２＋通??過Ｆｅｎｔｏｎ反應(yīng)產(chǎn)生輕自由基ＯＨ？與Ｆｅ３＋，最后輕自由基損傷蛋白、ＤＮＡ或脂??質(zhì)，最終引起細(xì)胞死亡（圖１－２）【１７，１８】。??ＮｄｈＨ??＾?ｆａｄｈ２??〇２?＋?Ｈ２０２??Ｆｅ??Ｆｅ?備??ＦＡＤＨ＊＾＾Ｆｅ２＾＾?Ｈ２Ｏｚ??ＦＡＤＨ２－＾?＾?Ｆｅ３＇＾?＾?ＨＯ－?Ｈ２０??感；－，?．％ｄ！?＂ｓｍ－??圖１－２?Ｆｅｎｔｏｎ反應(yīng)與輕自由基的產(chǎn)生??（來自?Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，?Ａｎｎｕａｌ?Ｒｅｖｉｅｗ?ｏｆ?Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，?２００３；?５７（１）：３９５）??１．３．１抗生素誘導(dǎo)ＲＯＳ生成??長期以來人們一直認(rèn)為抗生素的作用機理是通過作用于特異性靶點發(fā)揮其??殺菌作用。例如Ｐ－內(nèi)酰胺類抗生素通過與細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白（ＰＢＰｓ）結(jié)合，抑??制細(xì)菌細(xì)胞壁的增長從而抑制細(xì)菌的生長。氨基糖苷類抗生素具有陽離子親和性，??能結(jié)合革蘭氏陰性桿菌外膜和核酸中的帶負(fù)電荷的殘基，它們通過與原核１６Ｓ??ｒＲＮＡ的結(jié)合抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性從而達(dá)到殺菌的效??果［１９］。氟嗤諾酮類藥物是通過與ＤＮＡ促旋酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶ＩＩ，ｇｙｒ．４和ｇｙｒ５基??因的產(chǎn)物）和／或拓?fù)洚悩?gòu)酶ＩＶ?和；基因的產(chǎn)物）的直接結(jié)合，使得??４??

ｎａｌ）相對于野生型不加藥（Ｗ）表達(dá)變化較明顯的基因有７３個（表３－??３）。Ａｙ／紐突變株加藥（Ｙ＿ｎａｌ）相對于Ａｙ仇Ｅ突變株不加藥（Ｙ）表達(dá)變化較明??顯的基因有６９個（表３－４）。從圖中（圖３－１）可以直觀看到，突變株中部??分基因變化明顯，說明這些基因?qū)��?yīng)的代謝途徑受到ＹｉｈＥ的調(diào)控。同時，同一??菌株藥物處理相對于正常條件下發(fā)生變化的基因明顯變多，說明抗生素對細(xì)胞的??影響是很廣泛的。??８０?－Ｉ???Ｏｉｌ??Ｙ?ｖｓ?Ｗ?Ｖ＿ｎａ！?ｖｓ?Ｗ＿ｎａｌ?Ｗ＿ｒ？ａ！?ｖｓ?Ｗ?Ｙ＿ｎａｌ?ｖｓ?Ｙ??圖３－１顯著差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｇｅｎｅｓ??１８??
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本文編號：2869525