發(fā)布時(shí)間：2020-11-05 00:21

　　 噬菌體感染是微生物發(fā)酵工業(yè)面臨的一個(gè)棘手問題,至今仍無良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技術(shù)的噬菌體感染問題的解決方案。本文以肺炎克雷伯桿菌為例,從噬菌體的分離與分析開始,探究了天然CRISPR-Cas系統(tǒng)與(前)噬菌體之間的相互作用關(guān)系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌體基因組編輯技術(shù),探索了增強(qiáng)CRISPR-Cas9的噬菌體抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的資源從生物信息學(xué)的角度進(jìn)行的理論分析,也有從實(shí)驗(yàn)的角度對(duì)相關(guān)問題進(jìn)行的探索論證。主要研究結(jié)果如下:首先,對(duì)感染肺炎克雷伯桿菌工業(yè)發(fā)酵菌株的噬菌體進(jìn)行了分離、生理特性和基因組分析,并考察了噬菌體感染對(duì)1,3-丙二醇發(fā)酵過程的影響。系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果顯示,噬菌體phiKpS2屬于Kp34屬肺炎克雷伯桿菌噬菌體,是一類在自然界分布廣泛的克雷伯桿菌噬菌體。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明,噬菌體感染會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵長(zhǎng)時(shí)間停滯,發(fā)酵周期延長(zhǎng),生產(chǎn)效率降低。此外,發(fā)現(xiàn)噬菌體感染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響與感染時(shí)細(xì)胞所處生長(zhǎng)階段有密切關(guān)系。其次,對(duì)肺炎克雷伯桿菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)和前噬菌體進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。鑒定出了一種新的Ⅰ型CRISPR亞型,命名為I-E*,并對(duì)其基本特征包括在染色體上的位置、基因的組織結(jié)構(gòu)、Cas蛋白、tracrRNA的結(jié)構(gòu)、PAM位點(diǎn)和進(jìn)化來源等進(jìn)行了確定;CRISPR間隔序列主要來源于噬菌體、前噬菌體和質(zhì)粒,提示其主要功能是防止外來遺傳元件入侵。揭示了前噬菌體是肺炎克雷伯桿菌基因組可塑性的重要原因之一;在全球范圍內(nèi)流行的CG258型菌株含有較多高度保守的前噬菌體,包括其特有的兩個(gè)P2-P4噬菌體系統(tǒng);肺炎克雷伯桿菌染色體上的獲得型抗生素抗性基因(aARGs)集中存在于CG258型和CRISPR 陽(yáng)性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌體區(qū)域,而CRISPR 陽(yáng)性菌株的aARGs僅有10%位于前噬菌體區(qū)域,顯示CRISPR-Cas系統(tǒng)和CG258的前噬菌體可能分別獨(dú)立地參與了ARG在染色體上的整合。發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)和前噬菌體的分布都依賴與菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的間隔序列:這些可能是在肺炎克雷伯桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)前噬菌體的存在影響有限的原因。接著,對(duì)5株潛在肺炎克雷伯桿菌工業(yè)菌株的前噬菌體誘導(dǎo)性進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)其中一株菌的前噬菌體誘導(dǎo)過程進(jìn)行了定量分析,并對(duì)誘導(dǎo)出的兩個(gè)前噬菌體進(jìn)行了全基因組分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,肺炎克雷伯桿菌在絲裂霉素C(MMC)誘導(dǎo)下易發(fā)生前噬菌體大量增殖,細(xì)胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯桿菌W3的基因組中有2個(gè)可誘導(dǎo)的前噬菌體,且存在自發(fā)誘導(dǎo)現(xiàn)象。誘導(dǎo)出的噬菌體PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有同源噬菌體,說明是新的噬菌體類型。對(duì)前噬菌體攜帶的tRNA分析顯示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三種tRNA(tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr),是肺炎克雷伯桿菌前噬菌體中最常見的tRNA類型。前噬菌體在基因組中的高豐度、可誘導(dǎo)性及自發(fā)誘導(dǎo)性,說明在以肺炎克雷伯桿菌為基礎(chǔ)的發(fā)酵工業(yè)中前噬菌體是導(dǎo)致噬菌體感染的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。然后,建立了一種基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯桿菌噬菌體基因組編輯技術(shù)。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地實(shí)現(xiàn)包括點(diǎn)突變、基因刪除和插入、移碼突變?cè)趦?nèi)的多種遺傳操作,從而大大簡(jiǎn)化了基于CRISPR-Cas的噬菌體基因組編輯中繁瑣的模板構(gòu)建過程。通過對(duì)177個(gè)sgRNA的預(yù)測(cè)活性與實(shí)際測(cè)定活性的相關(guān)性分析,證實(shí)來源于真核生物的sgRNA預(yù)測(cè)模型不能用來預(yù)測(cè)針對(duì)噬菌體的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用來進(jìn)行基于同源重組的噬菌體基因組編輯,通過移碼突變可以快速的判斷噬菌體基因的必需性;并以噬菌體phiKpS2為例,通過移碼突變和基因刪除等,對(duì)其17%的基因的必需性進(jìn)行了初步驗(yàn)證。最后,分析了針對(duì)噬菌體的sgRNA的活性分布,考察了噬菌體從單一靶標(biāo)和多靶標(biāo)CRISPR-Cas系統(tǒng)中逃逸的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)Mu Gam干擾噬菌體DNA雙鏈斷裂修復(fù)可顯著增強(qiáng)CRISPR-Cas系統(tǒng)噬菌體抗性。在針對(duì)噬菌體的sgRNA中,活性低的sgRNA數(shù)量較多。在177個(gè)sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP0.1的sgRNA約占49.7%,而EOP10-4,即活性最高的那部分sgRNA僅占4.5%。噬菌體有多種逃逸CRISPR-Cas系統(tǒng)的方式,包括非同源末端接合、同源重組和靶向區(qū)域的大片度刪除。5個(gè)sgRNAs串聯(lián)的多靶標(biāo)CRISPR-Cas系統(tǒng)可促進(jìn)靶向區(qū)域的大片段刪除,但沒有顯著增強(qiáng)菌株的噬菌體抗性。發(fā)現(xiàn)Mu Gam蛋白可顯著增強(qiáng)CRISPR-Cas系統(tǒng)噬菌體抗性,且這種增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)不同活性的sgRNA均適用。表達(dá)Mu Gam后噬菌體逃逸的方式發(fā)生了改變,逃逸噬菌體中野生型和發(fā)生靶向區(qū)域大片段刪除的突變體都增加了。未來在對(duì)肺炎克雷伯桿菌發(fā)酵菌株選育的過程中需要進(jìn)行前噬菌體的誘導(dǎo)性檢測(cè),或考慮開發(fā)基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的前噬菌體清除技術(shù);另外,通過對(duì)噬菌體雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制的深入研究,未來可以設(shè)計(jì)更好的干擾策略來防止噬菌體逃逸。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q811.4
【部分圖文】：

宿主逃過噬菌體的捕食，而新的噬菌體突變體又會(huì)繼續(xù)威脅著宿主的安全。在這一過程??中，宿主的噬菌體抗性機(jī)制和噬菌體的適應(yīng)機(jī)制扮演著重要的角色。噬菌體和細(xì)菌的作??用機(jī)制如圖１．１所示。??１．１．３．１宿主的噬菌體抗性機(jī)制??從免疫學(xué)的角度看，細(xì)菌的噬菌體抗性機(jī)制可以分為兩大類：固有免疫和獲得性免??疫［２５］。前者出現(xiàn)在噬菌體生活史的各個(gè)階段，包括阻止噬菌體吸附、阻止ＤＮＡ注入、??剪切噬菌體核酸和流產(chǎn)感染系統(tǒng)。后者主要針對(duì)噬菌體的核酸，目前在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ和ｐＡｇｏ兩種獲得性免疫系統(tǒng)［２５］。??噬菌體吸附是其感染的第一個(gè)階段，細(xì)菌可以通過幾種方式來阻止噬菌體吸附，包??括吸附受體的丟失或表達(dá)下調(diào)，受體的突變和受體的空間阻遏［２１］。阻止噬菌體ＤＮＡ注??入一般是通過超感染排斥蛋白來完成的［２６］，這類蛋白常常由前噬菌體編碼。而當(dāng)噬菌體??的核酸注入細(xì)胞后，限制性修飾系統(tǒng)會(huì)對(duì)其進(jìn)行剪切，從而破壞噬菌體感染。另外，也??有些細(xì)菌在感染噬菌體后會(huì)啟動(dòng)程序性死亡

圖１．３基于傳統(tǒng)的基因工程的噬菌體抗性菌株構(gòu)建策略ｉ２１，１２２］。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ?ｏｆ?ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ?ｇｅｎｅｔｉｃ?ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ?ｔｏ?ｉｎｃｒｅａｓｅ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ??ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｆｏｒ?ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．??３基于ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的噬菌體抗性策略??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)是ＲＮＡ引導(dǎo)的細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對(duì)抗外來遺傳物質(zhì)??侵［３１］。僅需改變２０ｂｐ左右的核酸序列就可以實(shí)現(xiàn)ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的特異性切割，??該系統(tǒng)可以方便地用來進(jìn)行核酸修飾。然而，盡管ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)是在研宄工業(yè)??－１５?－??

圖１．４本文的主要研究?jī)?nèi)容??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｏｕｔｌｉｎｅ?ｏｆ?ｔｈｉｓ?ｒｅｓｅａｒｃｈ??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 南南;曹放;沈俊濤;繩傲楠;孫亞琴;牟英;修志龍;;一株產(chǎn)1,3-丙二醇的克雷伯氏菌的噬菌體生物學(xué)特性[J];微生物學(xué)報(bào);2013年09期

本文編號(hào)：2870827