發(fā)布時間：2020-11-05 02:25

　　 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)對臨床上常見的抗生素呈耐藥特性,號稱“超級細菌”。據(jù)統(tǒng)計,目前全球MRSA的感染率已超越乙型肝炎和艾滋病,穩(wěn)居世界難解決感染性疾病的首位。因此,研發(fā)新型、安全、高效的治療MRSA感染的藥物變得更加迫切。昆蟲腸道內(nèi)生微生物與宿主的營養(yǎng)物質攝取、生長發(fā)育以及抵御病原體入侵等生理功能密切相關。且昆蟲腸道內(nèi)環(huán)境與土壤、植物相比存在特殊性,其腸道內(nèi)環(huán)境中的共生微生物的代謝途徑可能在某種程度上受到昆蟲宿主腸道特殊環(huán)境的激活與調控,使這一類特殊來源的微生物更具有產(chǎn)生結構新穎、活性良好的天然產(chǎn)物的可能性。本課題組前期從蜚蠊腸道中分離得到18株具有抗MRSA活性的菌株。本文以MRSA作為指示菌,選取這18株菌中抗MRSA活性較好的菌株WA5-2-37為研究對象,并綜合運用形態(tài)學、分子生物學及系統(tǒng)發(fā)學等一系列的方法對菌株進行了初步的鑒定。同時,經(jīng)單因素優(yōu)化法和響應面分析法對菌株WA5-2-37的發(fā)酵條件進行優(yōu)化后,擴大其發(fā)酵規(guī)模,并以化學分離結合活性追蹤的手段,對菌株WA5-2-37所產(chǎn)生的抗MRSA活性次級代謝產(chǎn)物進行初步的研究。本論文主要結果如下:1、抗MRSA活性蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌的篩選:通過瓊脂擴散法、濾紙片法等方法,以MRSA作為指示菌,篩選出菌株編號為WA5-2-37的抗MRSA活性較好的蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌,該菌株的抑菌圈直徑可達22.30±0.42 mm。2、菌株WA5-2-37的分類鑒定:利用培養(yǎng)基生長特征分析、革蘭氏染色、掃描電子顯微鏡等手段對菌株WA5-2-37的生長形態(tài)進行觀察,并對菌株16S r DNA序列進行比對結果和系統(tǒng)發(fā)育樹結果進行分析。綜合分析上述研究結果,可初步鑒定菌株WA5-2-37為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus),該菌株的16S r DNA序列在NCBI的登錄號為MH304280。3、菌株WA5-2-37發(fā)酵條件的優(yōu)化:通過單因素優(yōu)化法和響應面分析法對菌株WA5-2-37的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。以MRSA作為指示菌,確定菌株WA5-2-37的最佳發(fā)酵條件為種齡34 h、接種量7%、發(fā)酵時長7天、發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H值6.9、裝液量300 m L/500 m L、培養(yǎng)溫度29.8℃、搖床轉速160 rpm/min。在此條件下菌株WA5-2-37發(fā)酵產(chǎn)物的抗MRSA活性最好,抑菌圈直徑可達23.82±0.21mm。4、菌株WA5-2-37抗MRSA活性次級代謝產(chǎn)物的分離純化及結構鑒定:根據(jù)菌株WA5-2-37的最佳發(fā)酵條件,對菌株進行擴大發(fā)酵。通過TLC、硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、HPLC、Semipreparative HPLC等方法,并結合活性追蹤,對菌株的抗MRSA活性次級代謝產(chǎn)物進行分離純化。同時,利用NMR、MS等波譜學方法,對從菌株活性次級代謝產(chǎn)物中分離得到的8個化合物進行結構解析,化合物1~8依次為:鄰苯二甲酸二丁酯、放線菌素X2、(6E)-4-甲氧基-5-(甲基砜)-6-(亞硝基亞乙基)-1,6-二氫-2′-聯(lián)吡啶、7-甲氧基-5-(2-吡啶基)異噻唑并[4,5-b]吡啶、3-氨基脫甲基(氧基)氨甲酰胺、環(huán)-(丙-脯)-二肽、環(huán)-(纈-脯)-二肽和環(huán)-(L-脯-L-酪)-二肽。5、單體化合物抗菌活性評價:對分離所得的化合物對MRSA、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的生長活性進行測定。結果顯示,化合物放線菌素X2和(6E)-4-甲氧基-5-(甲基砜)-6-(亞硝基亞乙基)-1,6-二氫-2′-聯(lián)吡啶對四種病原菌均具有較強的活性,其他化合物對四種病原菌均具有不同程度的抑菌活性。
【學位單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q935
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）研究進展
        1.1.1 MRSA感染現(xiàn)狀
        1.1.2 MRSA的耐藥機制
        1.1.3 抗MRSA感染藥物的研究進展
    1.2 昆蟲腸道共生放線菌次級代謝產(chǎn)物概述
        1.2.1 昆蟲共生放線菌抗菌活性次級代謝產(chǎn)物
        1.2.2 昆蟲共生放線菌抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物
        1.2.3 昆蟲共生放線菌其他生物活性次級代謝產(chǎn)物
    1.3 研究目的與意義
    1.4 研究內(nèi)容
    1.5 技術路線
第二章 抗MRSA活性蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌的篩選及鑒定
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗菌株
        2.2.2 培養(yǎng)基及主要試劑的配置
        2.2.3 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 菌株的活化
        2.3.2 抗MRSA活性菌株的篩選
        2.3.3 菌株WA5-2-37 形態(tài)學鑒定
        2.3.4 菌株WA5-2-37 分子生物學鑒定
    2.4 實驗結果
        2.4.1 抗MRSA活性菌株篩選
        2.4.2 菌株WA5-2-37 形態(tài)學觀察結果
        2.4.3 菌株WA5-2-37 分子生物學鑒定結果
    2.5 小結與討論
第三章 菌株WA5-2-37 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗菌株
        3.2.2 培養(yǎng)基及主要試劑的配置
        3.2.3 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 菌株WA5-2-37 最佳種齡的優(yōu)化
        3.3.2 菌株WA5-2-37 發(fā)酵天數(shù)的優(yōu)化
        3.3.3 菌株WA5-2-37 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化
        3.3.4 菌株WA5-2-37 發(fā)酵條件響應面法優(yōu)化
    3.4 實驗結果
        3.4.1 菌株WA5-2-37 最佳種齡的優(yōu)化結果
        3.4.2 菌株WA5-2-37 發(fā)酵天數(shù)的優(yōu)化
        3.4.3 菌株WA5-2-37 發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素法優(yōu)化
        3.4.4 菌株WA5-2-37 發(fā)酵培養(yǎng)條件響應面法優(yōu)化
    3.5 小結與討論
第四章 菌株WA5-2-37 次級代謝產(chǎn)物的初步研究
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗菌株
        4.2.2 培養(yǎng)基及主要試劑的配置
        4.2.3 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 菌株WA5-2-37 發(fā)酵粗提物的制備
        4.3.2 菌株WA5-2-37 發(fā)酵粗提物的分離純化
        4.3.3 單體化合物的結構鑒定
        4.3.4 化合物最小抑菌濃度測定
        4.3.5 掃描電子顯微鏡觀察單體化合物抗MRSA作用
    4.4 實驗結果
        4.4.1 菌株WA5-2-37 發(fā)酵粗提物的分離純化
        4.4.2 單體化合物的結構解析
        4.4.3 單體化合物的活性評價
        4.4.4 掃描電子顯微鏡觀察單體化合物抗MRSA作用
    4.5 小結與討論
第五章 總結與展望
    5.1 全文總結
    5.2 研究展望
參考文獻
附錄1 英文縮寫語中文對照
1H譜圖'>附錄2 化合物（1）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄3 化合物（1）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄4 化合物（2）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄5 化合物（2）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄6 化合物（3）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄7 化合物（3）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄8 化合物（4）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄9 化合物（4）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄10 化合物（5）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄11 化合物（5）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄12 化合物（6）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄13 化合物（6）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄14 化合物（7）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄15 化合物（7）核磁共振¹³C譜圖
1H譜圖'>附錄16 化合物（8）核磁共振¹H譜圖
13C譜圖'>附錄17 化合物（8）核磁共振¹³C譜圖
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本文編號：2870983