發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 01:24

　　 胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是一種依賴于一定的體外條件,能夠穩(wěn)定的自我更新,并保持多能性的細(xì)胞類型,一般來(lái)源于植入前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass,ICM)。眾所周知胚胎干細(xì)胞具有能夠無(wú)限期增殖的能力,并且可以分化為成體所有類型的細(xì)胞,這使得它們對(duì)藥物開發(fā)和再生醫(yī)學(xué)的研究具有特別重要的價(jià)值。不同狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞具有不同的多能性特征:Na?ve多能性狀態(tài),具有全面的分化潛能和嵌合體貢獻(xiàn)能力,以小鼠胚胎干細(xì)胞為代表;Primed多能性狀態(tài),具有受限的分化能力和嵌合體貢獻(xiàn)能力,以人類或靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞為代表。而在其他大動(dòng)物例如豬等物種中,Na?ve多能性狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞仍然未能成功獲得。第一株小鼠胚胎干細(xì)胞系在含有胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下建立,還有一種方式是通過(guò)添加白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)來(lái)促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立。然而,在以上條件下,只有129/SV品系的小鼠胚胎能夠有效的建立起胚胎干細(xì)胞系,而其他大多數(shù)品系的小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立仍然存在困難。直到2008年,人們利用含有MEK和GSK3抑制劑的2i培養(yǎng)體系,從許多其他通常被認(rèn)為無(wú)法成功獲得干細(xì)胞系的小鼠品系中建立了胚胎干細(xì)胞系。同時(shí),利用該體系也可成功從大鼠胚胎培養(yǎng)獲得大鼠胚胎干細(xì)胞系。此外,通過(guò)篩選能夠維持OCT4遠(yuǎn)端增強(qiáng)子活性的因子,建立了含LIF、Activin A和5種不同激酶抑制劑的5i/L/A培養(yǎng)體系,該體系可支持人Na?ve胚胎干細(xì)胞的自我更新,并能夠?qū)�Primed狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Na?ve多能性狀態(tài)。然而,這些體系似乎對(duì)小鼠或人以外的其他物種的Na?ve多能性胚胎干細(xì)胞的建立沒有效果。2017年,通過(guò)化學(xué)篩選,建立了一種添加了human LIF、CHR99021、(S)-(+)-dimethindene maleate(DiM)和minocycline hydrochloride(MiH)的培養(yǎng)基,稱為L(zhǎng)CDM,該條件下可同時(shí)從人和小鼠胚胎獲得具有參與胚胎和胚外組織嵌合體發(fā)育能力的多能性干細(xì)胞系,這些細(xì)胞被稱為擴(kuò)展多能干(Extended Pluripotent Stem,EPS)細(xì)胞,此研究開辟了從不同哺乳動(dòng)物建立具有嵌合體能力的多能干細(xì)胞的途徑。豬不僅是主要的肉食來(lái)源動(dòng)物,而且在代謝、免疫和生理上與人類非常相似,是生物醫(yī)學(xué)研究理想的動(dòng)物模型,此外由于其器官與人類器官大小相近,豬也是異種器官移植的潛在供體。因此,豬多能干細(xì)胞(porcine Pluripotent Stem Cells,pPSCs)的建立與培養(yǎng)已成為科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。然而,目前已發(fā)表的豬多能干細(xì)胞系都被證明是類胚胎干細(xì)胞系,這些細(xì)胞系大多表現(xiàn)出有限的多能性特征,無(wú)法形成畸胎瘤或生殖系嵌合體。因此,真正的豬多能干細(xì)胞系的建立與獲得是十分值得期待的。為了從豬胚胎中建立多能干細(xì)胞人們已經(jīng)做了許多努力。雖然尚未獲得真正的豬胚胎干細(xì)胞系,但已從各種不同來(lái)源的豬胚胎中建立獲得了許多假定的豬多能性干細(xì)胞系。然而,與小鼠胚胎干細(xì)胞相比,這其中大多數(shù)細(xì)胞系的多能性都差強(qiáng)人意,具體表現(xiàn)為這些豬多能干細(xì)胞注入裸鼠皮下無(wú)法畸胎瘤或者嵌合后不能參與到生殖系的發(fā)育中。先前的研究表明,不同來(lái)源的豬胚胎干細(xì)胞系表現(xiàn)出克隆形態(tài)扁平的特征,并且其體外和體內(nèi)的分化能力有限。它們?cè)诩?xì)胞多能性分類上屬于Primed狀態(tài),而非Na?ve狀態(tài)。據(jù)此,本研究采用豬體內(nèi)6.5天囊胚,利用LCDM體系,嘗試建立豬多能性干細(xì)胞,并通過(guò)小樣本高通量測(cè)序分析LCDM體系獲得的豬多能性細(xì)胞及小鼠、人EPS細(xì)胞中多能性基因表達(dá)模式和相關(guān)信號(hào)通路活性狀態(tài)。我們獲得的結(jié)果表明:(1)在不同體系下利用豬體內(nèi)胚胎建立的多能性干細(xì)胞系均取得較好的效果。其中KOFL培養(yǎng)體系下,在接種2枚豬體內(nèi)胚胎的情況下成功獲得了1株豬多能干細(xì)胞系PeNK6,獲得的細(xì)胞克隆形態(tài)與人胚胎干細(xì)胞相似,呈現(xiàn)出一種扁平的單層細(xì)胞的狀態(tài),堿性磷酸酶(AP)檢測(cè)的結(jié)果表明該細(xì)胞系呈陽(yáng)性的結(jié)果,即該細(xì)胞系具有多能性細(xì)胞的基本特征,免疫熒光檢測(cè)表達(dá)核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4,SOX2,NANOG,定量PCR檢測(cè)核心轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相一致。(2)在LCDM培養(yǎng)體系下,采用MEF或STO作為飼養(yǎng)層,對(duì)豬多能性干細(xì)胞建系效率不存在明顯的差別。獲得豬多能干細(xì)胞系,克隆形態(tài)呈扁平狀,但更加緊密,呈AP陽(yáng)性,表達(dá)核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4,SOX2,NANOG,同時(shí)細(xì)胞還表達(dá)SSEA3和SSEA4。具有體外分化的能力。(3)獲得的細(xì)胞系進(jìn)行了小樣本高通量測(cè)序分析,對(duì)小鼠,人和豬三個(gè)物種獲得的EPS/PSC中Na?ve和Primed相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)小鼠,人和豬中LCDM體系下建立的EPS細(xì)胞或PSCs并不同于ESCs細(xì)胞或ICM細(xì)胞的多能性特征,雖然都會(huì)有核心轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),但部分Na?ve和Primed相關(guān)基因的表達(dá)還是會(huì)存在差異。此外,對(duì)多能性信號(hào)通路激活情況也進(jìn)行了比較分析,結(jié)果顯示在LCDM培養(yǎng)體系中豬多能性干細(xì)胞中TGFβ信號(hào)通路處于高活性狀態(tài),這可能是影響該體系下獲得豬多能性干細(xì)胞系多能性的原因之一。據(jù)此,我們?cè)贚CDM培養(yǎng)基中添加TGFβ信號(hào)通路抑制劑SB431542。結(jié)果顯示,與pPSC-LCDM細(xì)胞系相比優(yōu)化體系培養(yǎng)的細(xì)胞不僅核心轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有所提高,細(xì)胞的增殖能力也顯著性增強(qiáng)。進(jìn)一步,通過(guò)小樣本高通量測(cè)序,我們建立了ICM向pPSC-LCDMs轉(zhuǎn)變過(guò)程中的基因表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示ICMs,BOs(blastocyst outgrowths)和PSCs的轉(zhuǎn)錄組具有較大差異,在胚胎接種后第1天,轉(zhuǎn)錄組即發(fā)生較大變化。結(jié)果顯示ICMs,BOs和PSCs的轉(zhuǎn)錄組具有較大差異,且BO5是獲得多能性干細(xì)胞過(guò)程中多能性變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。通過(guò)以上的結(jié)果,我們獲得以下結(jié)論:(1)在LCDM體系下,利用豬體內(nèi)胚胎建立豬多能性干細(xì)胞系的效率較高,建系效率可達(dá)50%左右,而且使用MEF或STO對(duì)建系效率沒有顯著影響。(2)LCDM培養(yǎng)體系可獲得具有一定多能性的豬胚胎干細(xì)胞系。(3)在LCDM體系下抑制TGFβ信號(hào)通路可有效提高豬多能性細(xì)胞系核心轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞增殖。(4)基因表達(dá)圖譜分析表明,ICM向豬多能性細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中的ICMs、BOs和PSCs轉(zhuǎn)錄組具有較大差異。并且在ICM到pPSCs過(guò)程中,涉及到的MAPK,JAK/STAT,TGFβ以及WNT等信號(hào)通路可能是影響豬胚胎干細(xì)胞系建立及多能性的關(guān)鍵信號(hào)通路。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q813
【部分圖文】：

圖 1-1 干細(xì)胞的起源與分類[8]Fig. 1-1 Origin and Classification of Stem Cells[8]是重要的家畜動(dòng)物，也是人類疾病模型和異種移植供體的最佳候選者之一，因小、形態(tài)和生理學(xué)上與人類有著眾所周知的相似性。豬多能干細(xì)胞的建立有助學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是對(duì)人類干細(xì)胞相關(guān)療法的有效性和安全性的評(píng)價(jià)幾十年來(lái)在小鼠和人的多能干細(xì)胞方面的研究取得了很大的進(jìn)展，但是豬和其多能干細(xì)胞的研究卻遇到了巨大的困難，而且目前沒有獲得任何能夠滿足小鼠

圖 1-2 PS 細(xì)胞效力測(cè)定[12]Fig. 1-2 Assays for assessing PS-cell potency[12]干細(xì)胞研究的進(jìn)展1 進(jìn)展概述鼠胚胎干細(xì)胞目前被認(rèn)為是研究最為透徹和廣泛的干細(xì)胞。早在 1981 年，人們鼠囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得了能夠在體外維持穩(wěn)定生長(zhǎng)是細(xì)胞—[1, 9]。為了維持胚胎干細(xì)胞的特征，即在體外能夠無(wú)限增殖并能夠一直維持未培養(yǎng)過(guò)程中有兩種不同的操作，一是可以用飼養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)接種小鼠的胚胎及培胚胎干細(xì)胞，或是使用條件培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，條件培養(yǎng)基來(lái)源于培養(yǎng)過(guò)小鼠培養(yǎng)液。相似的是，這兩種操作中都需要在培養(yǎng)液中添加血清成分，雖然血清產(chǎn)物其化學(xué)成分并不明確，但血清的存在對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)及維持極為驗(yàn)室所得到的細(xì)胞均可在體外無(wú)限增值，并保持分化為成體體內(nèi)幾乎所有類型1995 年，非人靈長(zhǎng)類的胚胎干細(xì)胞從接種后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)樣的細(xì)胞形成上皮樣細(xì)胞

8圖 1-3 多能性的動(dòng)態(tài)異質(zhì)性和階段性進(jìn)展模型[92]Fig. 1-3 Dynamic heterogeneity and phased progression models of pluripotency[9多能性涉及的信號(hào)通路/STAT3 和 BMP 是小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性主要依賴的信號(hào)通路細(xì)胞中情況不盡相同，主要參與多能性維持的信號(hào)通路涉及到 bFGF 和 Ac8-100]。有趣的是，來(lái)源于小鼠上胚層的多能性干細(xì)胞為了維持其多能性以及需要激活的信號(hào)通路卻是與人胚胎干細(xì)胞相同[26, 101, 102]。除了依賴于相同類不同物種來(lái)源的多能性細(xì)胞還具有其他類似的特征相似的特征，如克隆
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