發(fā)布時間：2020-11-12 07:53

　　 畢赤酵母已廣泛應用于重組蛋白的表達,這主要得益于其高效的P_(AOX1),該啟動子受甲醇的嚴格誘導,在其它碳源,如甘油、葡萄糖等碳源存在的情況下會被抑制。目前已對甘油或葡萄糖條件下,P_(AOX1)的調控機制進行研究,發(fā)現(xiàn)調控P_(AOX1)表達的激活性轉錄因子有Mxr1、Prm1和Mit1,抑制性的轉錄因子為Nrg1和Mig,并通過對這些轉錄因子進行改造獲得了非甲醇依賴型的畢赤酵母表達系統(tǒng)。甲醇具有易燃易爆、有毒等特點,這限制了畢赤酵母在大規(guī)模發(fā)酵、食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中的應用。畢赤酵母代謝甲醇時,需要消耗大量的能量合成醇氧化酶,其表達量占總可溶蛋白的30%。本研究通過對畢赤酵母中甲醇代謝途徑相關調控基因的改造,獲得非甲醇利用型的高產(chǎn)重組蛋白菌株,并通過轉錄組學方法深入分析菌株改造后基因表達的情況。具體研究內容和結果如下:(1)非甲醇利用型畢赤酵母高表達重組蛋白菌株的構建通過Cre/lox基因編輯體系,對甲醇代謝調控相關基因進行連續(xù)敲除,獲得了ΔAOX1-WT,ΔAOX1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-ΔNrg1-WT菌株,將這5株菌在甘油和甲醇混合的BMGYM培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,其中ΔAOX1/2-WT菌株在0.4%甘油+0.5%甲醇的BMGYM培養(yǎng)基中重組蛋白的表達水平是最好的,EGFP表達量較WT在BMMY中提高了53.6%。說明敲除AOX基因之后,有利于菌體提高重組蛋白的合成能力。(2)非甲醇利用型畢赤酵母高表達重組蛋白菌株的轉錄組學分析利用轉錄組學方法深入分析了AOX基因敲除之后菌體代謝途徑相關基因的表達情況。根據(jù)對差異表達基因富集分析的結果顯示,基因表達水平變化最多的是細胞的代謝途徑和基因信息加工途徑,并且這兩條途徑大部分基因的表達水平都是上調的。菌體通過下調甘油轉運蛋白GT1和甘油降解途徑相關基因的表達水平,緩解甘油對P_(AOX1)的抑制作用,實現(xiàn)在甘油存在的條件下P_(AOX1)的表達。在細胞代謝途徑中菌體通過上調糖酵解途徑和PPP途徑中的非氧化途徑,以及下調TCA循環(huán)為菌體代謝提供充足的前體、輔因子以及能量物質。菌體還通過上調蛋白質翻譯階段中核糖體蛋白表達水平和內質網(wǎng)中與蛋白質加工分泌相關的基因,來提高蛋白的分泌表達量。
【學位單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章 緒論 的催化下與 NAD+作用脫氫生成甲酸和一個 NADH，甲酸在 FDH 的續(xù)脫氫生成二氧化碳和一個 NADH。經(jīng)過這兩步脫氫反應，最終生成體的生長提供能量[15]。該途徑能夠對甲醛和甲酸進行脫毒，并且發(fā)揮8]。在同化途徑中，剩余的甲醛與過氧化物酶體中的 5-磷酸木酮糖（Xu合成酶（DAS）的催化下生成的二羥基丙酮（DHA）和 3-磷酸甘油醛胞質中以 6-磷酸果糖的形式參與到磷酸戊糖途徑中，生成 Xu5P 和 新進入到過氧化物酶體中參與甲醇的代謝，那么甲醇代謝的終產(chǎn)物就P，可參與 PYR，TCA 和呼吸過程來為菌體的生長和代謝提供能量。

圖 1-2 甲基營養(yǎng)型酵母甘油代謝途徑通路[32]Methylotrophic yeast glycerol metabolic pathway. The main abbrees and products in metabolic pathways are shown below. GUP1, 2:n/transporter 1, 2, GCY1: glycerol dehydrogenase, DHAP: dihydro, DHA: dihydroxyacetone, GUT1: glycerol kinase 1, GUT2: glycerydroxyacetone kinase, F6P: fructose 6-phosphate, Xu5P: xylulose 5raldehyde 3-phosphate, PYR: pyruvate, PPP: pentose phosphate patricarboxylic acid cycle.上的另一種與甘油轉運相關的跨膜蛋白 GT1，它能夠由胞外向胞內外的滲透壓平衡[33]。有研究表明，敲除 GT1 之后，在畢赤抑制方面都會產(chǎn)生影響，因此它在甘油調控 PAOX1活性的機理油轉運體 GT1 通過與 MXR1 相互作用來調控 PAOX1的活性的-141 至-138 的 CCCC 序列是 MXR1 的結合位點，因此 MXR P的活性。過表達 GT1 后細胞內甘油含量增加，抑制 MXR

第一章 緒論合，這不足以促進 PAOX1的表達。因此在葡萄糖條件下，PAOX1是培養(yǎng)在甘油培養(yǎng)基中時，Mxr1從細胞質中轉移到細胞核中同時與P核中的 Prm1 也結合到 PAOX1上，PMit1仍然受到 Nrg1 和 Mig 抑制， 與 PAOX1結合，Nrg1 依舊抑制 PAOX1的表達。由此可推測，Nrg1 在能和 Mxr1 和 Prm1 相似，從而競爭 PAOX1上的結合域來抑制 PAOX1條件下三種激活性轉錄因子都和 PAOX1結合，因此可以通過敲除 Mit1 來部分解除甘油對 PAOX1的抑制作用。在甲醇條件下，Mig 從細中，Nrg1 不再抑制 PAOX1和 PMit1的表達。Prm1 通過自激活高效表大量表達，累積的 Mit1 反過來抑制 Prm1 的表達，從而使細胞中 P個相對穩(wěn)定的范圍內。激活性轉錄因子 Mxr1，Prm1 和 Mit1 均與 處于高效表達的狀態(tài)。
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

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2 史碩博;陳濤;趙學明;;轉錄組平臺技術及其在代謝工程中的應用[J];生物工程學報;2010年09期

相關博士學位論文 前3條

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相關碩士學位論文 前2條

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本文編號：2880488