發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 07:01

　　 種子成熟是一個(gè)特異、復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程,不僅是決定種子質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵時(shí)期,也是影響種子貯藏質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。然而目前人們對(duì)種子成熟調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)還相對(duì)薄弱。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200nt、無(wú)編碼蛋白能力的RNA,近些年的研究表明它們?cè)谡婧松�物中種類豐富且分布廣泛,能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)或直接影響蛋白功能。目前人們對(duì)植物lncRNAs的功能及作用機(jī)理有了一定的認(rèn)識(shí),它們?cè)谠S多生物過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用,然而尚未見到lncRNA在種子成熟中的功能及其作用機(jī)制方面的報(bào)道。本研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的種子成熟調(diào)控因子鑒定體系,從種子貯藏蛋白的角度鑒定了介導(dǎo)種子成熟調(diào)控的lncRNAs并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索,主要研究結(jié)果如下:1.收集擬南芥4個(gè)發(fā)育時(shí)期(4、7、12、17 DAP)的種子,經(jīng)高通量檢測(cè)及生物信息學(xué)分析共得到64個(gè)響應(yīng)種子成熟的lncRNAs候選基因,其中24個(gè)為上調(diào)基因,40個(gè)為下調(diào)基因;24個(gè)lncRNAs位于基因轉(zhuǎn)錄模塊區(qū)域,35個(gè)為基因間lncRNAs,5個(gè)為反義lncRNAs。2.挑選了9個(gè)lncRNAs進(jìn)行了基因克隆并構(gòu)建到表達(dá)載體中,利用蘸花侵染將6個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNAs轉(zhuǎn)化入gus23(種子成熟報(bào)告基因體系),3個(gè)下調(diào)表達(dá)的lncRNAs轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因純合體后用于隨后研究。3.通過(guò)GUS染色方法對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)入gus23的基因是否參與種子成熟調(diào)控進(jìn)行了初步分析,結(jié)果表明lncRNA-Seed9和lncRNA-Seed53可以導(dǎo)致gus23幼苗真葉出現(xiàn)GUS表型,暗示種子貯藏蛋白基因SSPs在這2個(gè)lncRNA過(guò)表達(dá)幼苗中異位表達(dá)。隨后qPCR結(jié)果表明種子成熟調(diào)控因子LEC2與貯藏蛋白2S2基因在lncRNA-Seed53過(guò)表達(dá)幼苗中的表達(dá)量顯著高于野生型。進(jìn)一步對(duì)種子成熟主要調(diào)控因子在lncRNA-Seed53過(guò)表達(dá)植株種子中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明在lncRNA-Seed53過(guò)表達(dá)植株7 DAP的果莢中LEC2基因有著較小幅度的上調(diào)表達(dá);而在12 DAP的果莢中LEC1基因的表達(dá)量顯著提高。這些結(jié)果表明lncRNA-Seed53是一個(gè)種子成熟的調(diào)控因子。4.對(duì)轉(zhuǎn)基因植株種子及其它方面的表型進(jìn)行了分析,結(jié)果表明lncRNA-Seed53過(guò)表達(dá)植株果莢短且飽滿、果莢生長(zhǎng)緩慢、種子大等表型,此外在幼苗期具有葉柄短、蓮座葉圓且較小、早花、花苞緊湊且花瓣變短等表型。同時(shí),我們也觀察到lncRNA-Seed26過(guò)表達(dá)的種子萌芽受到抑制,并且植株具有萌芽晚,幼苗植株小的表型。5.為闡釋lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了準(zhǔn)備和初步探索。1)利用qPCR對(duì)2個(gè)lncRNAs的相鄰基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果表明lncRNA-Seed53可以抑制KIP1基因的表達(dá);在lncRNA-Seed26過(guò)表達(dá)幼苗中TPPI基因的表達(dá)量提高,LRR基因的表達(dá)降低。2)為了深入研究這些lncRNAs的功能,我們針對(duì)lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53分別設(shè)計(jì)了兩個(gè)gRNA靶點(diǎn),構(gòu)建了雙gRNA靶點(diǎn)saCas9/gRNA載體,并進(jìn)行了擬南芥轉(zhuǎn)化。經(jīng)篩選鑒定得到7株lncRNA-Seed26-CRISPR突變體植株,saCas9/gRNA載體編輯效率為2.083%;及3株lncRNA-Seed53-CRISPR突變體植株,saCas9/gRNA載體編輯效率為0.704%。3)我們通過(guò)生物信息學(xué)分析及重疊延伸PCR構(gòu)建了35S:S1streptavidin-tagged lncRNA-Seed26載體,并篩選鑒定出T_1代S1-lncRNA-Seed26轉(zhuǎn)基因植株,這為了鑒定該lncRNA的靶標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果拓展了人們對(duì)種子成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)及對(duì)植物lncRNA生物學(xué)功能的理解,為深入展開這些lncRNAs的調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖 1.1 植物種子成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與植物 lncRNA 的生物學(xué)功能Fig.1.1 Regulation network of seed maturation and the known lncRNA-mediatedprocesses1.2.4 植物 lncRNA 的作用機(jī)制許多 lncRNAs 的作用機(jī)制已在哺乳動(dòng)物[51-55]中得到了闡釋，并且很多研究表明 lncRNAs 與人類研究發(fā)育[56]、胚胎發(fā)育[57]、生殖細(xì)胞發(fā)育[58]以及人類疾病之間有著密切的聯(lián)系[59-64]。然而在植物中只有很少 lncRNAs 的作用機(jī)理得到了闡釋，可以歸納為以下幾個(gè)方面：1）通過(guò)“目標(biāo)模仿”（eTM）機(jī)制抑制 miRNA 的活性，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。最為經(jīng)典的例子就是擬南芥 lncRNA-AtIPS1 可以模仿 miR399 的靶標(biāo)PHO2，與 PHO2，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 miR399，從而促使 PHO2 的轉(zhuǎn)錄積累[65]。王秀杰實(shí)驗(yàn)室在擬南芥和水稻中分別鑒定了 36 和 189 個(gè) eTMs，說(shuō)明 lncRNAs 作為 eTM

研究方案與技術(shù)路線簡(jiǎn)圖

2.1.1 植物材料擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia 型，gus23（由加拿大農(nóng)業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。植株均培養(yǎng)于吉林大學(xué)和平校區(qū)邊少敏教授所屬培養(yǎng)室，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求不同，種植在草炭土與蛭石 3:1 的基質(zhì)或MS 培養(yǎng)基中。2.1.2 菌株及載體由上海麥琪公司購(gòu)買大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞及農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)細(xì)胞；用于 Gateway 載體構(gòu)建技術(shù)中的入門載體 pDONR207由中國(guó)科學(xué)院植物研究所劉永秀研究員惠贈(zèng)；植物載體、農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體pEarleyGate 100（含有 Bar 基因）由加拿大農(nóng)業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，如圖 2.1 所示。A B
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本文編號(hào)：2880425