發(fā)布時間：2020-11-15 20:49

　　 Dip2b基因是Disco關(guān)聯(lián)蛋白2(Disco-interacting protein 2,Dip2)基因家族的成員之一,Dip2編碼一類在脊椎動物和無脊椎動物中高度保守的蛋白。目前圍繞Dip2b基因的研究主要為利用高通量測序技術(shù),分析其作為分子標(biāo)記評估多種疾病的可能性,但有關(guān)Dip2b基因本身的生物學(xué)功能尚無報道。本實驗室的前期工作發(fā)現(xiàn),敲除Dip2b基因后小鼠呈活動力遲緩、呼吸節(jié)律緩慢、并出生后死亡的表型,雖然其致死機理尚不清楚,但表明Dip2b基因具有重要的生物學(xué)功能。由于出生缺陷通常可能與心肺功能發(fā)育異常等疾病相關(guān)聯(lián),為進(jìn)一步探究敲除Dip2b基因致胚胎發(fā)育異常的原因和作用機制,本研究首先探究了Dip2b基因在肺發(fā)育中的作用。利用攜帶LacZ-NEO報告基因的Dip2b基因敲除鼠模型進(jìn)行組織學(xué)觀察表明,Dip2b基因在小鼠肺部的氣管、支氣管及肺泡中表達(dá);冰凍切片染色結(jié)果顯示,Dip2b基因的表達(dá)位置主要為肺實質(zhì)結(jié)構(gòu),即氣管和肺泡的上皮組織,在肺的間充質(zhì)組織中未見表達(dá)。敲除Dip2b基因會導(dǎo)致小鼠結(jié)構(gòu)和功能異常,在結(jié)構(gòu)上,小鼠肺泡數(shù)量減少,間充質(zhì)組織過度發(fā)育,肺泡間隔板增厚,氣腔變小,呼吸性細(xì)支氣管數(shù)量減少;在功能上,新生小鼠的活動能力較差,呼吸節(jié)律較慢,皮膚呈青紫色并在24小時內(nèi)死亡。為進(jìn)一步探究Dip2b基因?qū)Ψ伟l(fā)育中基因表達(dá)的調(diào)控作用,對敲除Dip2b基因的小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果表明敲除Dip2b基因影響了多個肺發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程,KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明,Dip2b基因參與HH信號通路,與SHH、WNT5A等生長因子協(xié)同作用于小鼠肺發(fā)育和胚胎發(fā)育。最后,利用條件型敲除系統(tǒng)構(gòu)建了肺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,用于后續(xù)探究Dip2b基因?qū)ε咛グl(fā)育的調(diào)控作用。本研究通過分析Dip2b基因敲除后肺發(fā)育過程,分析了Dip2b基因影響肺發(fā)育的信號途徑,說明Dip2b參與肺發(fā)育,至少影響其部分肺的生物學(xué)功能,有可能是導(dǎo)致小鼠出生后死亡的原因。本研究為解析Dip2基因家族的生物學(xué)功能提供了新的依據(jù),并為治療相關(guān)遺傳疾病提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q344
【部分圖文】：

圖 1 Dip2btm1a/+小鼠模型驗證Figure 1 Confirmation of Dip2btm1a/+mice model）Dip2btm1a/+小鼠模型示意圖。紅色箭頭和藍(lán)色箭頭表示基因型鑒定引物的設(shè)計位點，其中acZ 引物 PCR 可獲得 350bp 大小條帶，野生型 Dip2b 引物 PCR 可獲得 300bp 大小條帶；（鑒定凝膠電泳圖。只有 Dip2b 引物條帶的為 Dip2b+/+野生型鼠，只有 LacZ 引物條帶2btm1a/tm1a純合鼠，同時具有兩條帶的為 Dip2btm1a/+雜合鼠；（C）qPCR 檢測 P0 時期不同基因織中 Dip2b 和 LacZ 基因表達(dá)量。Dip2b 基因在小鼠肺部表達(dá)情況由于小鼠模型中含有 LacZ 報告基因，并且該基因與 Dip2b 基因融合表達(dá)，所以的表達(dá)位置同樣為 Dip2b 基因的表達(dá)位置。因此使用 X-gal 進(jìn)行染色可以觀察在小鼠體內(nèi)的分布表達(dá)情況，從而了解 Dip2b 基因在體內(nèi)的分布表達(dá)情況。本要觀察 Dip2b 基因在小鼠肺部的表達(dá)情況。通過 Dip2btm1a/+雜合鼠肺部組織結(jié) LacZ 染色結(jié)果可以看出，Dip2b 基因在肺部有表達(dá)。其中，在氣管和肺葉中中表達(dá)較多（圖 2）。

圖 2 Dip2btm1a/+小鼠肺部整體 LacZ 染色Figure 2 Whole mount LacZ staining of Dip2btm1a/+mice lung structurea-c 為 Dip2b+/+野生型鼠，d-f 為 Dip2btm1a/+雜合鼠。其中 a，d 為肺部完整結(jié)構(gòu)；b，e 為部分肺葉結(jié)構(gòu)；c，f 為氣管。圖中比例尺為 2.5mm。為進(jìn)一步了解 Dip2b 基因在肺部具體的表達(dá)位置及表達(dá)情況，對 Dip2btm1a/+雜合鼠肺部組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行冰凍切片及 LacZ 染色。冰凍切片 LacZ 染色的結(jié)果表明，在肺葉中Dip2b 基因主要在肺泡，尤其是肺泡上皮組織中表達(dá)（圖 3）。在氣管中，Dip2b 基因同樣主要在氣管的上皮組織中表達(dá)（圖 4）。該結(jié)果表明，Dip2b 基因在肺部主要表達(dá)于氣管、支氣管和肺泡等實質(zhì)的上皮組織中，而在間質(zhì)的毛細(xì)血管、結(jié)締組織及淋巴等位置并無明顯表達(dá)。

圖 2 Dip2btm1a/+小鼠肺部整體 LacZ 染色Figure 2 Whole mount LacZ staining of Dip2btm1a/+mice lung structurea-c 為 Dip2b+/+野生型鼠，d-f 為 Dip2btm1a/+雜合鼠。其中 a，d 為肺部完整結(jié)構(gòu)；b，e 為部分肺葉結(jié)構(gòu)；c，f 為氣管。圖中比例尺為 2.5mm。為進(jìn)一步了解 Dip2b 基因在肺部具體的表達(dá)位置及表達(dá)情況，對 Dip2btm1a/+雜合鼠肺部組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行冰凍切片及 LacZ 染色。冰凍切片 LacZ 染色的結(jié)果表明，在肺葉中Dip2b 基因主要在肺泡，尤其是肺泡上皮組織中表達(dá)（圖 3）。在氣管中，Dip2b 基因同樣主要在氣管的上皮組織中表達(dá)（圖 4）。該結(jié)果表明，Dip2b 基因在肺部主要表達(dá)于氣管、支氣管和肺泡等實質(zhì)的上皮組織中，而在間質(zhì)的毛細(xì)血管、結(jié)締組織及淋巴等位置并無明顯表達(dá)。
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本文編號：2885188