發(fā)布時間：2020-11-18 08:08

　　 RNA降解體是rRNA成熟和mRNA降解過程中一個重要的酶復(fù)合體,主要由核糖核酸酶、RNA解旋酶及糖酵解酶組成。其中參與RNA降解的關(guān)鍵核糖核糖酸酶包括RNase E、RNase Y以及RNase J。RNase E介導(dǎo)了大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的RNA加工過程;RNase Y和RNase J則在革蘭氏陽性菌RNA加工過程中起著至關(guān)重要的作用。研究表明RNase Y是RNase E的同功蛋白,為革蘭氏陽性菌RNA降解體中的支架蛋白。RNase Y的缺失將導(dǎo)致革蘭氏陽性菌生長速率的減慢,并同時影響細(xì)胞形態(tài)、孢子形成以及抗生素的敏感性等,與細(xì)胞中毒性基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。此外,革蘭氏陽性菌的RNA降解過程還依賴于RNase J核糖核酸酶,其具有核酸內(nèi)切酶及5'-3'核酸外切酶活性。RNase J為釀膿鏈球菌生長所必需,然而其在枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌中卻能夠完全被敲除。關(guān)于革蘭氏陽性菌中RNA降解的具體機制目前尚不清楚。本文成功地解析獲得了耐輻射奇球菌RNase J(DraRNase J)與UMP及DraRNase J活性缺失點突變蛋白與6nt RNA復(fù)合體的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了相應(yīng)的生化實驗驗證。結(jié)果表明RNase J屬于β-CASP亞家族蛋白,具有保守的雙金屬離子(鋅離子)催化反應(yīng),其活性中心的兩個Zn離子介導(dǎo)了 OH·對RNA磷酸二酯鍵的親核攻擊。RNaseJ中還存有一個保守的基序,能夠特異性的識別底物RNA的5'端磷酸基團(tuán),決定了其核糖核酸外切酶活性的方向性;同時,Mn離子介導(dǎo)了該蛋白二聚化的過程,調(diào)控了 RNase J的核酸內(nèi)切酶/外切酶的活性轉(zhuǎn)換。這些研究成果揭示了革蘭氏陽性菌RNA成熟關(guān)鍵酶RNase J蛋白的催化和活性轉(zhuǎn)換機制,并首次為細(xì)胞內(nèi)高濃度錳離子調(diào)控RNA代謝相關(guān)酶活性提供了直接證據(jù)。此外,本文研究表明耐輻射奇球菌rnj全長基因及其C末端為細(xì)胞生長所必須,該基因的雜合突變子將導(dǎo)致耐輻射奇球菌生長速率減慢以及環(huán)境脅迫適應(yīng)性的降低。RNase Y能夠與RNase J在內(nèi)的多種RNA降解體相關(guān)組分相互作用。本文在耐輻射奇球菌中敲除了編碼RNase Y蛋白的my基因,并獲得了純合突變株。進(jìn)一步的研究表明該突變株能夠極大的敲低耐輻射奇球菌rnj基因的拷貝數(shù),造成耐輻射奇球菌生長速率的減緩,并且顯著影響其所具有的極端抗性。RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果表明rny的缺失將導(dǎo)致耐輻射奇球菌中代謝相關(guān)途徑,離子轉(zhuǎn)運相關(guān)途徑以及DNA損傷響應(yīng)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄本的富集,進(jìn)一步導(dǎo)致耐輻射奇球菌基因組穩(wěn)定性降低。此外,通過比較野生株和突變株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出了一系列潛在的RNaseY相關(guān)操縱子,為后續(xù)的研究提供了思路。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q935
【部分圖文】：

ＤＲ是一種常溫好氧型，不產(chǎn)生孢子，非運動型的非病原性細(xì)菌［５＿７】，在豐富??培養(yǎng)基中最適生長溫度是３０°Ｃ［８］。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的ＤＲ菌落外圍呈圓球形，??表面光滑（如圖１．１Ａ）。在透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)ＤＲ??的細(xì)胞外形呈球狀，直徑約為ｌ？２ｐｍ?（如圖１．１Ｂ）。通常，ＤＲ在生長的早期階??段以二聯(lián)體形式存在，在生長的后期階段，以四聯(lián)體形式存在［５］，圖１．１Ｂ中分別??顯示了?ＤＲ不同生長期的不同存在形式。ＤＲ的細(xì)胞壁具有較厚的肽聚糖層和外??外膜，在革蘭氏染色中呈陽性，是一種革蘭氏陽性菌［９］。培養(yǎng)ＤＲ通常使用ＴＧＹ??培養(yǎng)基（０．５?％?Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．３?％?Ｙｅａｓｔ?ｅｘｔｒａｃｔ、０？?１?％?Ｇｌｕｃｏｓｅ）?［１０］，培養(yǎng)溫度為?３０＿３２°Ｃ??［８］，其在對數(shù)生長期，細(xì)胞繁殖一代的周期大約為一小時。??Ｉ??

１＿??Ｓ］＆０ｄ０??圖１．１?ＤＲ的菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)圖Ａ．?ＤＲ的菌落形態(tài)；Ｂ．不同生長期的ＤＲ顯微結(jié)??構(gòu)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ．?Ａ．?Ｃｏｌｏｎｙ?ｐｉｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ?；??Ｂ．?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ?ａｔ?ｅａｒｌｙ?ｇｒｏｗｔｈ?ｐｈａｓｅ?（ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｉ）?ａｎｄ?ｌａｔｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｐｈａｓｅ?（ｔｅｔｒａｃｏｃｃｉ）．?Ｔｈｅ?ｓｃａｌｅ??ｂａｒ?ｉｓ?０．５?｜．ｕｎ＂＇－１２ｌ??Ｄｅｗｏｃｏｃｃｃｆｃｅａｅ科的細(xì)菌通常具有超強的ＩＩ射抗性。ＤＲ因其極強的電離福射??抗性廣為人知，并且它能夠在多種極端條件下如干燥、高強度紫外線（ＵＶ）、嚴(yán)??寒、酸性等環(huán)境中存活，被譽為“世界上最頑強的細(xì)菌”，并且因其作為研究電??離輻射抗性的模式生物，是目前研究較多的極端微生物之一［８］。??１．１．３耐輻射奇球菌的基因組組成??１９９９年Ｏｗｅｎ?Ｗｈｉｔｅ等人完成了?ＤＲ的基因組測序工作。ＤＲ的基因組由兩個??大小分別為２，６４８，６３８個堿基對的染色體Ｉ和４１２，３４８個堿基對的染色體丨Ｉ以及兩??個大小分別為１７７，４６６個堿基對和４５，７０４個堿基對的質(zhì)粒組成如圖Ｕ所示）。??該基因組包含３１８７個開放閱讀框（ＯＲＦ），平均大小為９３７ｂｐ，占基因組的９１％??（如表１．１所不）。系統(tǒng)發(fā)育研究表明，Ｚ）ｅ／＞７〇ｃｏｃｃ７＇屬與屬的細(xì)菌可能??具有共同的祖先［｜４］。通常

比如ＲｃｃＡ、ＰｐｒＡ等。ＰｐｒＩ的切割使得ＤｄｒＯ對ＤＮＡ損傷壓力響應(yīng)基??因的抑制解除，從而啟動ＤＮＡ損傷修復(fù)途徑。損傷修復(fù)后，ＤｄｒＯ重新結(jié)合于啟??動子，細(xì)胞重新回到正常生長狀態(tài)［１９］。圖１．４比較了典型ＳＯＳ修復(fù)途徑和ＤＲ中??Ｐｐｒｌ／ＤｄｒＯ介導(dǎo)的ＤＮＡ損傷響應(yīng)系統(tǒng)。??Ｃｌａｓｓｉｃ?ＳＯＳ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?Ｎｏｖｅｌ?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ??——？?ｓｏｓ?ＧＥＮＥＳ１＝?￣￣－?＾ｊｐｐＲＧ＾ＥｓＩｒ＾＾ｒ??〇〇Ｓ°〇?＋?＾?＜?悶?ｙ??ＲｅｃＡ－ｓｓＯＮＡ＾?＾?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ?＾?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ??１?心?Ａ?，???，?，??—￣［ｓｏｓ?ｇｅｎｅｓ?［：?—?■?｜ｄｄｒ?ｇｅｎｅｓ?ｐｚ?＇??。。?ＣＪ?＾?＇＿／—＾??Ａｕｔｏ－ｃｉｅａｖａｇｅ?（?Ｓｐｅａｋ?ｃｌｅａｖａｇｅ?Ｃ??＾ＲＮＡＰ＾ｊ?｜?ＳＯＳ?ＧＥＮＥＳ?｜Ｚ?￣?＝?｜????ｒｅｐａｉｒｅｄ?Ｈｒｄｒｍ?ｓｉｔｅ?ｒｅｐａｉｒｅｄ??圖１．４大腸桿菌中經(jīng)典ＳＯＳ修復(fù)系統(tǒng)與ＤＲ中Ｐｐｒｌ／ＤｄｒＯ介導(dǎo)的ＤＮＡ損傷修復(fù)系統(tǒng)的??比較??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｃｌａｓｓｉｃ?ＳＯＳ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｓｙｓｔｅｒｍ?ｉｎ?
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本文編號：2888507