發(fā)布時(shí)間：2020-12-09 02:57

　　葫蘆科作物是我國(guó)重要的水果和蔬菜,新品種的培育需要挖掘重要農(nóng)藝性狀的基因。黃瓜、西瓜和甜瓜等多種葫蘆科作物基因組已被測(cè)序,這為優(yōu)異基因的挖掘及其功能研究奠定了基礎(chǔ)。葫蘆科作物的遺傳轉(zhuǎn)化耗時(shí)費(fèi)力且轉(zhuǎn)化效率極低,病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技術(shù)為葫蘆科作物功能基因組學(xué)的研究提供了便利。本研究選擇在自然條件下可侵染葫蘆科作物的黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）為材料,采用該病毒的侵染性克隆,首先摸索外源基因片段插入的位點(diǎn)、其次鑒定外殼蛋白（Coat Protein,CP）亞基因組啟動(dòng)子（Subgenomic Promoter,SGP）,再分析沉默效應(yīng),從而構(gòu)建了可用于研究葫蘆科植物基因功能的VIGS載體。本文主要的研究結(jié)果如下:（1）明確了插入位點(diǎn)在CGMMV CP基因終止密碼子與3’非編碼區(qū)之間,不適合用于構(gòu)建VIGS載體。在CGMMV侵染性克隆pXT1-CGMMV的基礎(chǔ)上,通過(guò)點(diǎn)突變和同源重組的技術(shù)采取分段擴(kuò)增的方式獲得含單酶切位點(diǎn)HindIII的病毒載體1a2... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

本研究的技術(shù)路線圖

PCR 儀（RTC-100, MJ Research）；電泳儀（JY-ECP3000, 君意電泳）；凝膠成像io-Rad）；恒溫水槽（DK-8D, 上海精密）；離心機(jī)（CF15RX, 日本 Hitachi）；電子天京塞多利斯）；紫外分光光度計(jì)（ND-1000, 美國(guó) Thermo）；氣浴培養(yǎng)搖床（HZ-市華利達(dá)）；組織研磨儀（TL2010S, 北京鼎昊源）。.2 試驗(yàn)方法.2.1 分析 pXT1 與 CGMMV 基因組序列的酶切位點(diǎn)將構(gòu)建 CGMMV 侵染性克隆所用的植物表達(dá)載體 pXT1 的序列全長(zhǎng)和 CGMMV 基 因 組 全 長(zhǎng) 序 列 以 FASTA 格 式 輸 入 在 線 搜 索 工 具 NEBhttp://nc2.neb.com/NEBcutter2/），分析序列中存在的酶切位點(diǎn)。.2.2 CGMMV CP 基因后插入位點(diǎn)的病毒載體的構(gòu)建.2.2.1 構(gòu)建策略首先，基于對(duì) pXT1 和 CGMMV 序列中酶切位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)這兩條序列中均indIII 酶切位點(diǎn)，該酶切位點(diǎn)存在于 pXT1 序列的首部，在 CGMMV 基因組序列中與密碼子共用一個(gè)堿基 T（如圖 2.1）。

位論文 第二章 CGMM驗(yàn)室構(gòu)建的一系列CP突變體對(duì)CGMMV的致氨基酸絲氨酸（TCG）突變?yōu)榻K止密碼子（基因組序列中本存在的 HindIII 酶切位點(diǎn)作為 基因后插入位點(diǎn)構(gòu)建病毒載體的策略為：首 HindIII 酶切位點(diǎn)和改變 CGMMV CP 基因ndIII-S 和 S159Z-X/S159Z-S；再以 DelHindIII組的 5' 端片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的片段長(zhǎng)-S 為引物對(duì) CGMMV 侵染性克隆的 3' 端片段用同源重組的方法將兩個(gè)片段連接到一起，23。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)及其在植物中的研究進(jìn)展[J]. 張新華,李富軍.  西北植物學(xué)報(bào). 2012(02)
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[7]防治監(jiān)控黃瓜綠斑駁花葉病毒,確保瓜類(lèi)安全生產(chǎn)[J]. 古勤生.  中國(guó)瓜菜. 2007(01)

博士論文
[1]矮牽牛轉(zhuǎn)錄因子PhOBF1和PhERF2影響病毒誘導(dǎo)基因沉默效率的機(jī)理研究[D]. 孫道陽(yáng).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016

碩士論文
[1]草莓鑲脈病毒（SVBV）啟動(dòng)子的鑒定[D]. 李瑞.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：2906130