發(fā)布時間：2024-05-21 20:40

　　谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是機體抗氧化酶學防線的重要成員,已經(jīng)有大量的研究證明了它們的重要作用。GPx和SOD相互協(xié)同清除多種活性氧(ROS)以保護機體免受氧化損傷,同時它們還能組成相互保護的防御體系,這種協(xié)同作用是機體正常代謝必不可少的,如果這種協(xié)同作用被破壞,可將ROS的損傷效應放大�；�于兩者的協(xié)同作用,獲取含有GPx和SOD活性雙功能抗氧化酶,相比于單功能抗氧化酶具有更高的應用價值。同時天然酶存在著穩(wěn)定性差、來源少的缺點,極大限制了它們的應用,因此如何獲得具有高活力、高穩(wěn)定性的雙功能抗氧化酶成為了我們的目標,基于這個目標,我們開展了以下研究工作:1.基于h GPx1與Ap SOD的雙功能抗氧化酶的表達與表征聯(lián)合使用半胱氨酸缺陷型表達系統(tǒng)和單一蛋白表達系統(tǒng)(SPP),在人GPx1突變基因(h GPx1Ser)和龐貝蠕蟲SOD基因(Ap SOD)的基礎(chǔ)上設(shè)計構(gòu)建了多種兼具GPx和SOD活性的雙功能融合蛋白,對活力最高的Se-h GPx1Ser-L-Ap SOD的酶學性質(zhì)進行了研究,并驗證了該融合蛋白的協(xié)同作用。2.基于h GPx1與Ap SOD的雙功能抗氧...

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
提要
中文摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 緒論
    1.1 活性氧
        1.1.1 活性氧概述
        1.1.2 ROS的來源
        1.1.3 氧化應激
        1.1.4 ROS與人類疾病
        1.1.5 ROS的控制
    1.2 谷胱甘肽過氧化物酶
        1.2.1 GPx概述
        1.2.2 GPx分類
        1.2.3 GPx的結(jié)構(gòu)
        1.2.4 含硒GPx催化機制
    1.3 硒與硒蛋白
        1.3.1 硒的概述
        1.3.2 Sec的合成
        1.3.3 Sec的插入機制
        1.3.4 人工硒蛋白的獲得方法
    1.4 超氧化物歧化酶
        1.4.1 SOD概述
        1.4.2 SOD與人類健康
        1.4.3 SOD結(jié)構(gòu)
        1.4.4 SOD的催化機制
    1.5 兼具多功能酶活性的人工酶
    1.6 立題依據(jù)及研究策略
第二章 基于hGPx1與ApSOD的雙功能抗氧化酶的表達與表征
    2.1 序言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 實驗試劑
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 菌株與質(zhì)粒
        2.2.4 試劑配方
        2.2.5 實驗方法
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 ApSOD全基因合成
        2.3.2 基因的調(diào)取
        2.3.3 構(gòu)建表達質(zhì)粒及鑒定
        2.3.4 非含硒融合蛋白的表達及純化
        2.3.5 含硒雙功能融合蛋白的表達及純化
        2.3.6 蛋白活力測定
        2.3.7 Se-hGPx1^Ser-L-ApSOD的計算機結(jié)構(gòu)模擬分析
        2.3.8 Se-hGPx1^Ser-L-ApSOD的最適溫度及p H測定
        2.3.9 Se-hGPx1^Ser-L-ApSOD的穩(wěn)定性研究
        2.3.10 Se-hGPx1^Ser-L-ApSOD的GPx穩(wěn)態(tài)動力學研究
        2.3.11 Se-hGPx1^Ser-L-ApSOD的ESI-MS檢測
        2.3.12 抗過氧化氫失活實驗
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 基于hGPx1與ApSOD的雙功能抗氧化酶的活力改善
    3.1 序言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗試劑
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 菌株與質(zhì)粒
        3.2.4 試劑配方
        3.2.5 實驗方法
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 pCold-hGPx1^Ser-lL-ApSOD和pRSF-hGPx1_UAG-lL-ApSOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 pCold-hGPx1-lL-ApSOD(C/S)突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.3 含硒雙功能融合蛋白的表達及純化鑒定
        3.3.4 蛋白活力的測定
        3.3.5 融合蛋白的計算機結(jié)構(gòu)模擬分析
        3.3.6 Se-hGPx1_UAG-lL-ApSOD的性質(zhì)表征
        3.3.7 Se-hGPx1^Ser-lL-ApSOD及Se-hGPx1_UAG-lL-ApSOD的GPx穩(wěn)態(tài)動力學研究
        3.3.8 ESI-MS檢測Se-GPx1_UAG-lL-ApSOD的精確分子量測定
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 基于hGPx2與ApSOD的雙功能抗氧化酶的表達與表征
    4.1 序言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 實驗試劑
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 質(zhì)粒與菌株
        4.2.4 實驗方法
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 基因的調(diào)取
        4.3.2 雙功能融合蛋白的表達及純化鑒定
        4.3.3 蛋白活力測定
        4.3.4 Se-hGPx2_UAG-lL-ApSOD的酶學性質(zhì)研究
        4.3.5 Se-hGPx2^Ser-lL-ApSOD和Se-hGPx2_UAG-lL-ApSOD的穩(wěn)定性研究
        4.3.6 Se-hGPx2_UAG-lL-ApSOD的GPx穩(wěn)態(tài)動力學研究
        4.3.7 雙功能融合蛋白的計算機結(jié)構(gòu)模擬分析
        4.3.8 抗過氧化氫失活實驗
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)語與創(chuàng)新點
參考文獻
作者簡介及攻讀學位期間取得的成績
攻讀學位期間取得的成果
致謝



本文編號：3979892