發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 23:09

　　 高原牧區(qū)牦牛奶資源豐富,牧民世代沿用傳統(tǒng)而古老的自然發(fā)酵方法制作酸奶,牦牛發(fā)酵乳中蘊(yùn)含著遺傳穩(wěn)定性好、抗逆性強(qiáng)、發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌。雖然國(guó)內(nèi)學(xué)者在乳酸菌的篩選等方面做了大量的研究,但目前可以投入商業(yè)化應(yīng)用的乳酸菌仍然較少。甘南獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境孕育了豐富多樣的微生物資源,發(fā)酵及抗氧化能力強(qiáng)的乳酸菌是提升食品品質(zhì)的關(guān)鍵。以甘南牧區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵的牦牛酸乳為試材,在對(duì)所篩選的優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵性能測(cè)定的基礎(chǔ)上,對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行了對(duì)比分析。并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株開展了重離子加速誘變,研究了誘變菌株對(duì)發(fā)酵乳感官、理化及氧化性能的影響,旨在從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選出發(fā)酵性能和抗氧化性能優(yōu)良的乳酸菌。研究結(jié)果如下:1.乳酸菌分離鑒定及特性。甘南傳統(tǒng)牦牛酸奶樣品中共分離出了46株菌株,經(jīng)耐受過氧化氫、耐酸、耐膽鹽、凝乳性能測(cè)定,篩選出了6株優(yōu)勢(shì)菌株,在通過抗氧化活性篩選出1株菌株;糖發(fā)酵試驗(yàn)及16S rDNA鑒定證明M5為副干酪乳桿菌(L.paracasei)。M5對(duì)DPPH、?OH、O_2~-·清除率在菌體濃度為1×10~9CFU/mL的無細(xì)胞提取物下分別為48.4%、4.76%、49.9%;酵母存活細(xì)胞模型驗(yàn)證M5菌株的無細(xì)胞提取物、發(fā)酵上清液、完整細(xì)胞對(duì)釀酒酵母的存活率分別提高了95.3%、130%和28.5%。2.M5菌株重離子束誘變篩選。采用0-360 Gy劑量重離子束輻照M5菌懸液,研究結(jié)果表明,輻照劑量360 Gy致死率高達(dá)90.13%;100-140Gy劑量正突變率為26.9%-21.3%顯著高于負(fù)突變率14.3%-11.8%,100Gy劑量下有助菌株正向突變。經(jīng)碳酸鈣平板篩選、24孔深孔板和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,篩選出了在20 Gy劑量下,發(fā)酵及抗氧化強(qiáng)的突變株N1。N1液體培養(yǎng)發(fā)酵26h產(chǎn)酸能力為14.4g/L,較出發(fā)菌株M5提高了42.15%;無細(xì)胞提取物總抗氧化性、羥自由基抑制力和金屬Fe~(2+)的螯合力分別為0.166mM FeSO_4、49.19 U/mL、3.06%,較M5提高了23.8%、34%和402%。9代斜面?zhèn)鞔�培養(yǎng),突變株N1遺傳穩(wěn)定性良好。3.誘變菌株特性。生長(zhǎng)曲線N1和M5菌株差異不顯著,24h培養(yǎng)OD_(600)吸光度為1.8-1.9。菌株N1在pH3.0和0.3%牛膽鹽存活率為58.9%和45.7%,較M5提高了10.5%和4.58%,自凝聚力提高了20.1%。耐受胃液力及菌株表面疏水性菌株N1與M5無明顯差異,基本形態(tài)均有所改變,N1較M5耐受腸液能力下降了4.29%。4.發(fā)酵乳特性。在同等發(fā)酵條件下,N1與M5發(fā)酵乳在7d時(shí)感官無明顯差異,但營(yíng)養(yǎng)成分評(píng)價(jià)中,N1發(fā)酵乳具有較高的第一限制性氨基酸評(píng)分。發(fā)酵乳DPPH·清除活性分別為92.31%與89.96%,60min亞鐵離子的螯合力分別為76.15%與67.11%,清除H_2O_2活性分別為25.01%與11.85%,抗氧化優(yōu)于M5菌株。上述研究表明,甘南傳統(tǒng)酸奶所篩選的副干酪乳桿菌M5,經(jīng)重離子束誘變所獲得的優(yōu)勢(shì)菌株N1,其產(chǎn)酸能力、抗氧化能力均有所提升,發(fā)酵乳具有良好的益生性能,具有生產(chǎn)發(fā)酵菌劑的潛質(zhì)。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：TS252.54
【部分圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文耐受膽鹽的能力是益生菌株的在腸道環(huán)境中存活的必備條件。菌株的生長(zhǎng)受膽酸鹽的影響十分巨大，不同菌株的膽鹽耐受性差異明顯，大部分菌株耐膽鹽效果較好，存活率在30%以上，則表明其具有較高的耐受活性。3.2抗氧化菌株篩選3.2.1DPPH自由基清除率因DPPH有單電子，當(dāng)有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)是就會(huì)清除DPPH的單電子，增加DPPH的穩(wěn)定性，溶液也隨之將顏色從紫色變?yōu)辄S色，在517nm處具有吸光度，可用分光光度計(jì)來檢測(cè)溶液的褪色情況，進(jìn)而測(cè)定DPPH的清除能力[81]。圖3-1各菌株對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.3-1DPPHradical-scavengingabilityof6screenedstrains注：圖中不同字母（a-e）表示不同菌株相同處理下差異顯著（p〈0.05）,下同如圖3-1所示，6株乳酸菌的CFS、IC和CFE處理組均表現(xiàn)出了的DPPH自由基清除能力，但不同菌株對(duì)DPPH自由基清除能力表現(xiàn)不同。CFS和CFE組中較強(qiáng)清除能力的為M5，IC組中清除能力較強(qiáng)的為T4和M11�？傮w來看，菌株M5的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其中CFS處理組中清除率高達(dá)47.8%，顯著高于其他菌株的CFS處理組，其IC組合CFE組的清除率分別為42.7%和48.4%。該菌株的清除自由基的活性物質(zhì)大部分是代謝分泌物與完整細(xì)胞，胞內(nèi)物質(zhì)也存在少量的抗氧化活性物質(zhì)，這與郭慧芬等[82]學(xué)者研究基本一致。有報(bào)道顯示，乳酸菌具有DPPH自由基清除活性可能和菌體產(chǎn)生的胞外多糖有關(guān)，Xu等[83]的研究顯示DPPH自由基的清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關(guān)。

甘南傳統(tǒng)牦牛酸奶中抗氧化菌株分離、誘變及篩選213.2.2OH自由基清除率羥自由基是一種存活時(shí)間短但卻具有很強(qiáng)氧化性的自由基。它可以與氧化劑產(chǎn)生反應(yīng)生成紅色物質(zhì)。在532nm處具有強(qiáng)烈的吸光度，可以用分光光度計(jì)來檢測(cè)溶液的褪色情況判定抗氧化能力強(qiáng)弱[84]。圖3-2各菌株OH清除率測(cè)定結(jié)果Fig.3-2Hydroxylradical-scavengingabilityof6screenedstrains由圖3-2可知，M5的CFS組對(duì)OH的清除率為54.4%，顯著高于其它組；CFE組中M8的清除能力較高，為29.3%；IC組中M5、M8和Mx表現(xiàn)出較高的清除能力，分別為36.9%、34.4%和33.5%。相同菌株的OH自由基清除能力中CFS處理組高于IC和CFE處理組，說明這幾株乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)主要存在菌體表面以及代謝產(chǎn)物中而非胞內(nèi)，不同乳酸菌的羥自由基清除能力因其活性物質(zhì)的種類和含量不同而存在定差異，這與李默等[85]研究具有相似性。3.2.3超氧陰離子（O2－·）清除率鄰苯三酚自氧化，作為供電子體在325nm處具有吸光度[86]。從圖3-3中可以看出菌株CFE組表現(xiàn)極高的清除能力為M5；IC處理組中清除能力較強(qiáng)的為G4；CFS處理組中表現(xiàn)較好的菌株為M5。不同菌株對(duì)超氧陰離子的清除能力表現(xiàn)出較大的差異性能，菌株M5的CFE清除率最高為49.9%；菌株CFS處理組的清除O2-的能力低于相同菌株的CFE處理組。試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，乳酸菌清除O2－·的活性物質(zhì)大部分存在于胞內(nèi)。菌株M5CFE的清除率高于陳明[87]篩選LparacaseiBX62CFE為31.98%的清除活性。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文圖3-3各菌株對(duì)O2－清除效果Fig.3-3Superoxideanionradical-scavengingabilityof6screenedstrains乳酸菌菌體及無細(xì)胞提取物具有超氧陰離子自由基清除能力可能是由于其菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物中存在各種各樣的氧化酶。有報(bào)道顯示，乳酸菌存在不同的活性氧族（reactiveoxygenspecies，ROS）解毒機(jī)制，包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和各種各樣的氧化酶。以菌株的抗氧化能力為主，結(jié)合菌株的耐酸性以及高耐膽鹽和凝乳發(fā)酵性能，從46株中最終挑選出具有良好的表現(xiàn)能力的M5菌株，對(duì)菌株M5進(jìn)行酵母細(xì)胞驗(yàn)證試驗(yàn)。3.3酵母存活細(xì)胞模型Fontana等[88]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的衰老代謝機(jī)制與人體細(xì)胞衰老機(jī)制相似。Burtner[89]認(rèn)為在研究氧化應(yīng)激損傷中釀酒酵母是理想的生物模型，具有簡(jiǎn)單而獨(dú)特的生長(zhǎng)代謝規(guī)律。由圖3-4可知，在加入乳酸菌的發(fā)酵上清液、完整細(xì)胞組和無細(xì)胞提取物后，經(jīng)H2O2處理的酵母細(xì)胞的增長(zhǎng)率都有所提高，增長(zhǎng)率分別為130%、28.5%和95.3%，其中菌株M5的發(fā)酵上清液與無細(xì)胞提取物的氧化應(yīng)激保護(hù)作用更加明顯。圖3-4釀酒酵母細(xì)胞增長(zhǎng)Fig.3-4Saccharomycescerevisiaecellgrowth
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870747