發(fā)布時間：2020-11-11 05:19

　　 目的:通過食品級加工技術(shù)獲得低致敏卵類粘蛋白產(chǎn)物,探索其表位與致敏性變化的關(guān)系,為低致敏或脫敏雞蛋產(chǎn)品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。方法:1.卵類粘蛋白的分離純化:新鮮雞蛋去殼并分離雞蛋黃后,先通過預(yù)處理除去卵粘蛋白等干擾蛋白,再應(yīng)用CM-Sepharose FF陽離子交換層析法,使卵類粘蛋白先于卵白蛋白洗脫出來,消除卵白蛋白含量大、出峰時間長對卵類粘蛋白純化的影響,從而獲得高純度卵類粘蛋白。通過電泳和質(zhì)譜分析進行鑒定,通過灰度分析蛋白純度。收集純度大于90%的卵類粘蛋白。2.卵類粘蛋白的去折疊與烷基化處理:采用谷胱甘肽還原法和半胱氨酸還原法破壞分子內(nèi)二硫鍵。根據(jù)電泳圖譜中各目標(biāo)條帶的泳動率,檢測不同還原條件下的去折疊效率及兔血清IgG結(jié)合能力,結(jié)合與過敏患者血清IgE結(jié)合能力確定最優(yōu)還原條件,制備去折疊卵類粘蛋白用于后續(xù)實驗。在還原法破壞卵類粘蛋白的二硫鍵后,由于還原條件的改變或還原劑量降低易導(dǎo)致二硫鍵重新折疊,因此,在檢測前先通過烷基化反應(yīng)屏蔽巰基,并利用離心濃縮除去過量反應(yīng)物使結(jié)果更精確。3.美拉德反應(yīng)影響卵類粘蛋白致敏性條件的優(yōu)化:加熱溫度、加熱時間、還原糖種類、還原方法的不同以及還原糖的比例等是美拉德反應(yīng)重要的影響因素。先通過單因素實驗確定影響卵類粘蛋白致敏性的因素,然后根據(jù)結(jié)果來判斷是否需要繼續(xù)通過響應(yīng)面法進行優(yōu)化,將反應(yīng)條件最優(yōu)的卵類粘蛋白產(chǎn)物用于下一步研究。4.糖化卵類粘蛋白免疫反應(yīng)性的評估:將去折疊前后的卵類粘蛋白糖化并誘導(dǎo)其重新折疊,通過間接EILSA或競爭抑制ELISA檢測去折疊前后卵類粘蛋白的兔血清IgG結(jié)合能力和雞蛋過敏患者血清IgE結(jié)合能力,選擇結(jié)合能力最低的糖化產(chǎn)物,通過圓二色譜、紫外光譜和熒光光譜分別分析其二級和三級結(jié)構(gòu)特征,通過與烷基化卵類粘蛋白比對,確定卵類粘蛋白重新折疊發(fā)生;通過與未處理卵類粘蛋白比對,確定二硫鍵是否在原來的位置重新形成。5.動物實驗評估卵類粘蛋白產(chǎn)物致敏性:用低IgE結(jié)合卵類粘蛋白產(chǎn)物免疫小鼠,通過觀察小鼠過敏癥狀、檢測致敏小鼠血清中IgE,IgG,IgG1,IgG2a的水平、檢測脾細(xì)胞IL-4,IL-10,IL-13等細(xì)胞因子水平的變化等完成動物實驗評估。結(jié)果:1.卵類粘蛋白的分離純化:經(jīng)過一個完整的分離過程(2 h),可以收集到14.33mg卵類粘蛋白,得率為45.8%,純度為94.1%,顯示出與卵類粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品相似的免疫活性。2.最佳還原條件:選擇谷胱甘肽作為還原劑,還原劑濃度為1 mg/ml時,產(chǎn)物與小鼠血清IgG及人血清IgE結(jié)合能力下降最顯著。3.去折疊卵類粘蛋白結(jié)構(gòu)變化:二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主,熒光光譜結(jié)果顯示疏水性改變。4.最佳糖化條件:麥芽糖與卵類粘蛋白賴氨酸殘基比例為10:1,加熱溫度為90℃,加熱時間為8 h時,與兔血清IgG結(jié)合能力結(jié)果顯示該糖化條件加工后的卵類粘蛋白(G-M-OVM)的IC_(50)值由0.3741μg/ml上升到112.6μg/ml,與過敏患者血清IgE結(jié)合能力檢測結(jié)果顯示G-M-OVM相比于未加工的卵類粘蛋白(OVM)IgE結(jié)合能力顯著下降(P0.05)。5.卵類粘蛋白的重新折疊:誘導(dǎo)重新折疊的卵類粘蛋白未完全在原來的位置發(fā)生折疊。6.動物實驗評估:小鼠血清特異性抗體IgE、IgG、IgG1和IgG2a水平相比于未加工的卵類粘蛋白組小鼠均下降(P0.05)。與未加工的卵類粘蛋白比較,加工后的卵類粘蛋白刺激脾臟產(chǎn)生的IL-4,IL-17A和IFN-γ的水平均下降(P0.05)。結(jié)論:1.本研究開發(fā)了一種簡單方便的色譜方法,可以在2小時內(nèi)分離出高純度的卵類粘蛋白,與商業(yè)卵類粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品具有相似的免疫活性,可以用于實驗室研究。2.通過去折疊-糖化-重新折疊獲得低致敏卵類粘蛋白產(chǎn)物。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：TS253.1
【部分圖文】：

技術(shù)路線Fig1.Technicalroute

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文梁汭·17(7)終止反應(yīng)：每孔加入50μl2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。(8)比色：用酶標(biāo)儀在490nm處測吸光值。1.4結(jié)果1.4.1CM-SepharoseFF陽離子交換層析法純化蛋清中的卵類粘蛋白根據(jù)卵類粘蛋白的等電點和CM-SepharoseFF的使用說明，將蛋清上樣溶液的pH調(diào)至3.8。預(yù)先用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.7）平衡層析介質(zhì),在蛋清上樣后用相同的緩沖液洗脫。當(dāng)層析柱的pH從3.8增加到4.7后，在上樣后60、230和260min分別洗脫出三個峰，洗脫曲線如圖1.1所示。結(jié)合三個分離峰的SDS-PAGE（圖1.2）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一個峰(F1)中洗脫出蛋白質(zhì)為卵類粘蛋白；卵白蛋白在第二和第三個峰(F2和F3)中洗脫出來(圖1.2a)。從圖2.2a的F1泳道可以發(fā)現(xiàn)卵類粘蛋白顯示出彌散條帶，該結(jié)果與Bloom的結(jié)果相同[54]，原因可能是由于卵類粘蛋白的高糖基化率。將分離的卵類粘蛋白凍干后，取90μg上樣，結(jié)果仍未顯示雜質(zhì)(圖1.2b)，通過灰度分析顯示本實驗分離的卵類粘蛋白的純度達(dá)到94.09%。F2以卵白蛋白為主，純度為79.03%。通過圖1.1發(fā)現(xiàn)，在120min時，卵類粘蛋白已經(jīng)完全洗脫出來，卵白蛋白的純化延長了分離過程。通過以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，CM-SepharoseFF可以在上樣2h內(nèi)獲得卵類粘蛋白純品。圖1.1CM-SepharoseFF分離蛋清組分（F）陽離子層析曲線

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文梁汭·18Fig1.1Elutionpatternoftheeggwhitefractions(F)obtainedbyCM-Sepharosefastflowcation-exchangechromatography圖1.2(a)通過離子交換層析獲得的分離峰和(b)較高濃度(90μg)的純化卵類粘蛋白的SDS-PAGEFig1.2SDS-PAGEof(a)fractionsobtainedbyion-exchangechromatographyand(b)purifiedovomucoidloadedatahigherconcentration1.4.2卵類粘蛋白的得率經(jīng)凱氏定氮法測得全蛋清中蛋白質(zhì)含量為11.38％。經(jīng)過一個完整的分離純化過程，收集到14.33mg卵類粘蛋白，得率為45.8％。表1.1與報道方法相比本方案純化卵類粘蛋白的得率與純度Table1.1Yieldandpurityofovomucoidpurifiedinthisprotocolcomparedwithreportedmethod方法純度(%)得率(%)CM-SepharoseFF陽離子交換層析柱(本方案)94.145.8Q-SepharoseFF聯(lián)合CM-Toyopearl650M陽離子交換色譜法[55]90.021.0乙醇沉淀加酸性硫酸銨沉淀卵類粘蛋白[56]91.4100.0不同濃度的乙醇沉淀卵類粘蛋白[56]92.3100.0三氯乙酸加硫酸銨兩步純化卵類粘蛋白[57]99.227.1雙水相系統(tǒng)[58]ND90.0ND：NotDetected
【參考文獻(xiàn)】

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2 王帥;吳子健;劉建福;胡志和;王連芬;;雞卵類黏蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究進展[J];食品科學(xué);2014年17期

3 陳紅兵;高金燕;;食物過敏反應(yīng)及其機制[J];營養(yǎng)學(xué)報;2007年02期

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本文編號：2878800