發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 12:49

　　 四川黑茶具有獨(dú)特的地域性和政治特征,其品質(zhì)高低直接影響邊疆少數(shù)民族同胞的身體健康、邊疆穩(wěn)定和民族團(tuán)結(jié)。渥堆作為四川黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序,其濕熱環(huán)境有利于微生物的生長(zhǎng)、繁殖,渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶等水解酶類(lèi)對(duì)四川黑茶品質(zhì)的轉(zhuǎn)化及形成功不可沒(méi)。研究者對(duì)黑茶渥堆過(guò)程的微生物進(jìn)行了大量研究,但對(duì)四川黑茶渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶及其相關(guān)性質(zhì)的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。因此,明確四川黑茶渥堆微生物中分泌纖維素酶、果膠酶的主要微生物種類(lèi),研究其纖維素酶特性,深入分析其在四川黑茶品質(zhì)形成中的具體作用,對(duì)于擴(kuò)大食品等行業(yè)纖維素酶、果膠酶微生物來(lái)源及其進(jìn)一步應(yīng)用,縮短四川黑茶生產(chǎn)周期,提高其品質(zhì)具有重要意義。此外,進(jìn)一步探索和優(yōu)化微生物纖維素酶產(chǎn)酶條件,對(duì)于提高微生物纖維素酶活性具有重要的實(shí)踐意義。本研究擬采用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)手段,微生物平板技術(shù)及常用手段相結(jié)合的方式,篩選四川黑茶渥堆微生物中纖維素酶、果膠酶分泌菌株,并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究,對(duì)纖維素酶分泌菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行探索和優(yōu)化。此外,采用液態(tài)發(fā)酵的方式分析纖維素酶、果膠酶分泌菌株對(duì)液態(tài)茶品質(zhì)成分的影響。主要研究結(jié)果如下：(1)從四川黑茶渥堆微生物中共篩得分解纖維素效果較好的菌株18株,其中,酵母菌1株,霉菌6株,放線(xiàn)菌7株,細(xì)菌4株,其分解纖維素能力大小依次為：放線(xiàn)菌細(xì)菌酵母菌霉菌。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),放線(xiàn)菌分泌纖維素酶活性整體高于細(xì)菌和真菌,綜合初篩、復(fù)篩結(jié)果,選擇SDT18、SDT53、SDT95號(hào)菌株為分泌纖維素酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT18、SDT95、 SDT53號(hào)菌株初步鑒定為Aspergillus niger strain FCBP648(黑曲霉)、Bacillus subtilis strain ZZ120(枯草芽孢桿菌)、Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus strain HDJZ-zwm-45(淀粉酶鏈霉菌亞種)。搖瓶培養(yǎng)期間,SDT95號(hào)菌株其菌株生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),而其CMCase和FPA酶活性并未出現(xiàn)大幅度的變化；使SDT95號(hào)菌株的CMCase酶活達(dá)到最大時(shí)的酶反應(yīng)pH為5,使其CMCase酶活較高的酶反應(yīng)溫度依次為45℃55℃40℃50℃。(2)在液體培養(yǎng)基組分及濃度優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組分及濃度進(jìn)行優(yōu)化,得出利于纖維素酶分泌菌株SDT95產(chǎn)CMCase的液體培養(yǎng)基組分配比為：葡萄糖1.68%,牛肉膏0.82%,氯化鈉0.32%,磷酸氫二鉀0.22%,利于菌株產(chǎn)FPA的液體培養(yǎng)基組分配比為：葡萄糖1.63%,牛肉膏0.86%,氯化鈉0.37%,磷酸氫二鉀0.16%。在搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)搖床培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,得出利于SDT95菌株CMCase酶活提高的搖床培養(yǎng)條件為：菌株接種量2m1,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間6d,搖床培養(yǎng)溫度29℃。實(shí)驗(yàn)所考察的3個(gè)因素對(duì)FPA酶活的影響均較小,FPA酶活可能還受到其它未被考慮進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案的因素所影響。(3)從四川黑茶渥堆微生物中初篩得到分泌果膠酶效果較明顯的菌株共19株,其中,酵母菌1株,霉菌6株,放線(xiàn)菌9株,細(xì)菌3株。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)測(cè)得各類(lèi)群微生物分泌果膠酶活性依次為放線(xiàn)菌細(xì)菌霉菌酵母菌。結(jié)合初篩、復(fù)篩結(jié)果選得SDT22、SDT60、SDT87號(hào)菌株為分泌果膠酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT22、SDT87、SDT60號(hào)菌株初步鑒定為Penicillium commune strain G20-23(普通青霉)、Streptomyces thermoviolaceus(熱紫鏈霉菌)、Streptomyces pactum strain 173612(密旋鏈霉菌)。(4)篩得的分泌纖維素酶、果膠酶效果較好的菌株在以純茶湯為培養(yǎng)基的單菌液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中均能造成茶湯中茶多酚含量的降低；除SDT93號(hào)菌株外,均能造成茶湯中茶黃素含量的增加；供試菌株對(duì)茶湯茶紅素、茶褐素含量的影響相對(duì)比較復(fù)雜；除SDT4、87、93號(hào)菌株外,所有試驗(yàn)菌株相較空白對(duì)照均能使茶湯中氨基酸含量得到提高；與空白對(duì)照相比,SDT52、53、59、60、87、93、95、102號(hào)菌株分別使茶湯中可溶性糖含量增加,而SDT4、10、13、18、22、29、40、64號(hào)菌株則分別使茶湯中可溶性糖含量降低；除SDT93號(hào)菌株外,試驗(yàn)茶湯中水溶性果膠含量相較空白對(duì)照均出現(xiàn)增加的情況。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：TQ925
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫(xiě)詞（ABBREVIATION）
第一章 緒論
    1 黑茶中主要微生物種群
        1.1 云南普洱茶中的主要微生物種群
        1.2 湖南茯磚茶中的主要微生物種群
        1.3 四川黑茶中的主要微生物種群
        1.4 廣西六堡茶及湖北青磚中的主要微生物種群
    2 微生物與黑茶品質(zhì)形成
        2.1 微生物與普洱茶品質(zhì)形成
        2.2 微生物與湖南茯磚茶品質(zhì)形成
        2.3 微生物與四川黑茶品質(zhì)形成
    3 微生物促進(jìn)黑茶品質(zhì)形成的主要途徑
        3.1 微生物胞外酶與黑茶品質(zhì)形成
        3.2 微生物熱與黑茶品質(zhì)形成
    4 纖維素酶、果膠酶的微生物來(lái)源及其分泌菌株的篩選
        4.1 纖維素酶的微生物來(lái)源及其分泌菌株的篩選
            4.1.1 纖維素酶的微生物來(lái)源
            4.1.2 纖維素酶分泌菌株的篩選方法
        4.2 果膠酶的微生物來(lái)源及其分泌菌株的篩選
            4.2.1 果膠酶的微生物來(lái)源
            4.2.2 果膠酶分泌菌株的篩選方法
    5 本研究的目的與意義
第二章 四川黑茶渥堆過(guò)程中纖維素酶分泌菌株篩選及其酶學(xué)特性初步研究
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 纖維素酶分泌菌株的篩選
            1.3.2 纖維素酶高產(chǎn)菌株的鑒定
            1.3.3 纖維素酶酶學(xué)特性初步研究
            1.3.4 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 四川黑茶渥堆過(guò)程中纖維素酶分泌菌株的篩選
            2.1.1 纖維素酶分泌菌株初篩
            2.1.2 纖維素酶分泌菌株復(fù)篩
        2.2 纖維素酶高產(chǎn)菌株的鑒定
            2.2.1 纖維素酶高產(chǎn)菌株的分子鑒定
            2.2.2 纖維素酶高產(chǎn)菌株的形態(tài)學(xué)及理化特性分析
        2.3 纖維素酶酶學(xué)特性初步研究
            2.3.1 菌株生長(zhǎng)特性
            2.3.2 酶反應(yīng)pH、溫度對(duì)纖維素酶活性的影響
    3 討論與小結(jié)
        3.1 討論
        3.2 小結(jié)
第三章 纖維素酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 液體培養(yǎng)基組分及濃度的優(yōu)化
            1.3.2 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化
            1.3.3 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 液體培養(yǎng)基組分及濃度的優(yōu)化
            2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)
            2.1.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)
        2.2 搖床培養(yǎng)條件的優(yōu)化
            2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)
            2.2.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)
    3 討論與小結(jié)
第四章 四川黑茶渥堆過(guò)程中果膠酶分泌菌株篩選及初步鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 果膠酶分泌菌株的篩選
            1.3.2 果膠酶高產(chǎn)菌株的鑒定
            1.3.3 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 四川黑茶渥堆過(guò)程中果膠酶分泌菌株的篩選
            2.1.1 果膠酶分泌菌株初篩
            2.1.2 果膠酶分泌菌株復(fù)篩
        2.2 果膠酶高產(chǎn)菌株的鑒定
            2.2.1 果膠酶高產(chǎn)菌株的分子鑒定
            2.2.2 果膠酶高產(chǎn)菌株的形態(tài)學(xué)及理化特性分析
    3 討論與小結(jié)
第五章 纖維素酶、果膠酶分泌菌株對(duì)四川黑茶品質(zhì)影響的研究
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 試驗(yàn)方法
            1.3.1 純茶湯培養(yǎng)基的制備
            1.3.2 菌株接種發(fā)酵
            1.3.3 茶葉主要品質(zhì)成分測(cè)定
            1.3.4 數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 纖維素酶分泌菌株對(duì)四川黑茶主要品質(zhì)成分的影響
        2.2 果膠酶分泌菌株對(duì)四川黑茶主要品質(zhì)成分的影響
    3 討論與小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
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