發(fā)布時間：2018-08-19 14:56

【摘要】：維甲酸X受體(RetinoidXreceptor,RXR)是多種環(huán)境污染物和藥物作用的重要靶點,三苯基錫(triphenyltin,TPT)是典型的RXR激動劑。有機錫被認為是人為引入海洋系統(tǒng)中的致毒效應最大的化學物質(zhì)之一。然而,我們前期的研究卻發(fā)現(xiàn),TPT對熱帶爪蟾胚胎的致畸效應與RXR的激動劑9-順式維甲酸(9-cis retinoic acid,9c-RA)、氟蓓薩羅汀(Fluorobexarotene,FBA)的截然不同,而與RXR高選擇性抑制劑UVI3003的非常相似。因此,我們猜測在熱帶爪蟾胚胎中,TPT與UVI3003的致畸機制可能存在相似之處。本論文以熱帶爪蟾胚胎為實驗模型,系統(tǒng)運用了基因組學、qRT-PCR定量、顯微注射、整胚原位雜交、細胞轉(zhuǎn)染等技術,比較研究了 TPT和UVI3003對熱帶爪蟾胚胎的致畸機制。首先,根據(jù)熱帶爪蟾胚胎的生長發(fā)育階段特征,在NF 10-43時期劃分出7個暴露窗口,分別進行UVI3003處理。UVI3003對不同發(fā)育時期的熱帶爪蟾胚胎引起的畸形表型和畸形程度不同,致畸能力在胚胎NF 10-25階段較弱,NF 25-39時期明顯增加,NF39-43時期又有所降低。UVI3003在熱帶爪蟾胚胎中引起的特征性畸形表型包括:小頭、晶狀體渾濁、泄殖腔異常、皮膚色素減少和窄鰭。UVI3003的qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示,與RXR相關的核受體基因在胚胎整個發(fā)育過程中受到的影響具有階段差異性。但是,UVI3003在整個熱帶爪蟾胚胎暴露過程中都明顯抑制了PPAγ基因的表達,同時上調(diào)了受PPARy負調(diào)控的基因mmp1。TPT也同樣地對PPARγ和mmp1的表達值產(chǎn)生了相似的的影響。以上結果說明PPARγ基因在UVI3003致畸過程中具有重要作用。基因芯片結果顯示,在溫和作用窗口下,250、500、750μg/LUVI3003共同影響了rps15,serp2,fmr1,cyp2e1 lrrc9,ugtla 和LOC100490188七個基因的表達,主要影響的作用通路包括糖代謝、胰島素信號通路和類固醇信號通路;在敏感作用模式下,18個基因被顯著調(diào)控,UVI3003主要干擾了 PPAR信號通路、谷胱甘肽代謝和氮代謝。RXR-RAR被認為是維甲酸(Retinoic acid,RA)致畸的首要作用途徑,但是在溫和作用和敏感作用兩種模式下都沒有發(fā)現(xiàn)UVI3003對RA信號通路的影響。根據(jù)以上結果,我們推測PPAR信號通路更有可能是UVI3003對熱帶爪蟾胚胎致畸效應的潛在機制。進一步的核受體活性熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現(xiàn),在體外(Cos7細胞)、與爪蟾胚胎體內(nèi)TPT與UVI3003都可以有效地激活爪蟾PPARγ;同時,UVI3003卻對人類PPARy和小鼠PPARy基本沒有活性。由此說明了激活PPARy是導致TPT與UVI3003在爪蟾胚胎體內(nèi)引起相似畸形表型的潛在機制。本研究首次提出了 RXR高選擇性抑制劑UVI3003同時是爪蟾特異的PPARy核受體激動劑的新觀點,揭示了 TPT和UVI3003對爪蟾胚胎的致畸機制。為了研究PPARγ基因在TPT致畸過程中的功能作用,我們利用顯微注射方法,在兩細胞期熱帶爪蟾胚胎的單側(cè)分別注射150 pgPPARγ mRNA和10 ng E2I2 Morpholino,從而過表達和敲落PPARγ基因。之后,將注射過的胚胎再次暴露在0、5、15、20 μgSn/LTPT溶液中。PPARγ過表達可以導致熱帶爪蟾胚胎的眼睛變小,在TPT暴露后此畸形表型得到了拯救;PPARγ基因敲落具有很強的致畸性,導致了熱帶爪蟾胚胎的多種畸形表型,這種致畸性與20 μgSn/LTPT暴露可以產(chǎn)生毒性疊加效應,導致胚胎死亡。PPP4Rγ的時空表達模式顯示,在神經(jīng)胚時期,PPARγ主要集中在神經(jīng)嵴和神經(jīng)管中表達。以上結果說明PPARγ基因下調(diào)的強致畸性在TPT致畸過程中具有重要貢獻。以上結果在敏感基因PPARγ對TPT暴露的響應與胚胎眼睛畸形表型特征之間建立了聯(lián)系。最后,為了研究RXR在維甲酸致畸過程中的的作用貢獻,本文分別選取了RAR與RXR的選擇性激動劑全反維甲酸(all-trans retinoic acid,at-RA)、氟蓓薩羅汀(FBA)以及二者的共同激動劑9-順式維甲酸(9c-RA),利用基因芯片技術,比較解析三種激動劑對熱帶爪蟾胚胎基因表達譜的影響。由于三種激動劑引起的畸形表型高度相似,本文利用圖像處理軟件具體測量了每一種特征性表型,給出了定量的表型數(shù)據(jù),辨別出了三種激動劑致畸效應的細微差異�；�因芯片結果顯示,RAR激動劑at-RA主要干擾了視黃醇代謝、糖酵解、淀粉和蔗糖代謝信號通路,RXR激動劑則產(chǎn)生了更加廣泛的干擾,除了影響能量穩(wěn)態(tài)方面的通路以外,還干擾了脂肪細胞因子信號通路、胰島素耐受性、FoxO信號通路和PPAR信號通路。RXR是核受體家族中多個核受體的配體,這一特性開啟了以下可能,RXR激動劑可以通過激活RXR影響到多種容許型二聚體下游的生物效應,如RXR-PPAR。因此,我們認為RXR激動劑的致畸作用途徑不只是通過已知的RXR-RAR通路,RXR-PPAR在致畸過程中也起到了重要作用。綜上所述,本文首次提出了 RXR高選擇性抑制劑UVI3003同時是爪蟾特異的PPARγ核受體激動劑的新觀點;揭示了激活PPARγ是導致TPT與UVI3003在爪蟾胚胎體內(nèi)引起相似畸形表型的潛在機制;建立了敏感基因PPARγ對TPT暴露的響應與胚胎眼睛畸形表型特征之間的聯(lián)系。同時,本文利用基因芯片技術篩選出了大量的維甲酸化合物的敏感作用基因,為建立RXR與RAR干擾物的篩選方法提供了分子指標數(shù)據(jù)。
[Abstract]:Retinoid X receptor (RXR) is an important target for a variety of environmental pollutants and drugs. Triphenyltin (TPT) is a typical RXR agonist. Organotin is considered to be one of the most toxic chemicals introduced into the marine system artificially. However, our previous studies have found that TPT has the greatest toxic effect on Xenopus embryos. The teratogenic effects of RXR agonists 9-cis retinoic acid (9c-RA), fluorobexarotine (FBA) are quite different from those of RXR highly selective inhibitors UVI3003. Therefore, we speculate that TPT and UVI3003 may have similar teratogenic mechanisms in Xenopus laevis embryos. The teratogenic mechanism of Xenopus laevis embryos induced by TPT and UVI 3003 was studied by genomics, qRT-PCR quantitative analysis, microinjection, whole embryo in situ hybridization and cell transfection. Firstly, according to the characteristics of Xenopus laevis embryos, seven exposure windows were divided in the period of NF 10-43. The teratogenic ability of UVI3003 was weaker in the stage of NF 10-25, increased significantly in the stage of NF 25-39, and decreased in the stage of NF 39-43. The characteristic phenotypes of malformation caused by UVI3003 in the embryos of Xenopus laevis were microcephaly and lens. The QRT-PCR data of UVI3003 showed that the effects of RXR-related nuclear receptor genes on the whole embryonic development were different in stages. However, UVI3003 significantly inhibited the expression of PPA-gamma gene and up-regulated the negative expression of PPARy during the whole embryonic exposure of Xenopus tropicalis. These results suggest that the PPAR gamma gene plays an important role in the teratogenic process of UVI3003. The results of gene chip analysis show that 250,500,750 ug/LUVI3003 together affect rps15, serp2, fmr1, CYP2E1 lrrc9, ugtla and LOC1004 under mild window. The expression of 901887 genes is mainly affected by glucose metabolism, insulin signaling pathway and steroid signaling pathway. Under the sensitive mode, 18 genes are significantly regulated. UVI 3003 mainly interferes with PPAR signaling pathway, glutathione metabolism and nitrogen metabolism. RXR-RAR is considered to be the first teratogenic pathway of retinoic acid (RA). According to the above results, we speculate that the PPAR signaling pathway is more likely to be the potential mechanism of teratogenic effect of UVI3003 on Xenopus tropicalis embryos. It was found that both TPT and UVI3003 could effectively activate Xenopus laevis PPARy in vitro (Cos7 cells) and Xenopus laevis embryos, while UVI3003 had little activity on human PPARy and mouse PPARy. This indicated that activation of PPARy was a potential mechanism leading to similar abnormal phenotypes of TPT and UVI3003 in Xenopus laevis embryos. The new view that XR highly selective inhibitor UVI3003 is a Xenopus-specific PPARy nuclear receptor agonist at the same time reveals the teratogenic mechanism of TPT and UVI3003 on Xenopus laevis embryos. In order to study the function of PPARgamma gene in the teratogenic process of TPT, we injected 150 pgPPA into Xenopus laevis embryos by microinjection. Rgamma mRNA and 10NG E2I2 Morpholino overexpressed and knocked out the PPAR gamma gene. The injected embryos were then re-exposed to 0,5,15,20 UG Sn/LTPT solution. Several abnormal phenotypes of Xenopus tropicalis embryos were identified. The teratogenicity and exposure to 20 UG Sn/LTPT produced a toxic superposition effect leading to embryo death. The expression pattern of PPP4R gamma in the neural crest and canal during the embryonic period showed that the expression of PPAR gamma was mainly in the neural crest and canal. These results have established a link between the response of the sensitive gene PPARgamma to TPT exposure and the phenotypic characteristics of embryonic eye malformations. Finally, in order to study the role of RXR in retinoic acid teratogenesis, all-trans retinoic acid (at-trans retinoic acid) was selected as the selective agonist of RAR and RXR, respectively. RA, FBA and their co-agonists 9-cis-retinoic acid (9c-RA) were used to compare and analyze the effects of the three agonists on gene expression profiles of Xenopus laevis embryos by gene chip technique. The results of gene chip analysis showed that RAR agonist at-RA mainly interfered with retinol metabolism, glycolysis, starch and sucrose metabolism signaling pathways, while RXR agonists interfered with a wider range of energy homeostasis pathways. It also interferes with adipocytokine signaling pathways, insulin tolerance, FoxO signaling pathways, and PPAR signaling pathways. RXR is the ligand of multiple nuclear receptors in the nuclear receptor family. This characteristic opens the possibility that RXR agonists can affect the downstream biological effects of multiple allowable dimers, such as RXR-PPAR, by activating RXR. RXR-PPAR plays an important role in the teratogenic process as well as through the known RXR-RAR pathway. In conclusion, a new viewpoint that the highly selective inhibitor of RXR, UVI3003, is also a Xenopus-specific PPAR gamma receptor agonist, has been proposed for the first time in this paper. The potential mechanism of Xenopus laevis embryos to induce similar phenotypes was established, and the relationship between the response of sensitive gene PPARgamma to TPT exposure and the phenotypic characteristics of embryonic eye malformation was established. Molecular index data are provided.
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X174

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本文編號：2191997