發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 11:23

　　 靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的生物支架材料在組織工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力主要?dú)w因于其人為可控的納米級(jí)纖維結(jié)構(gòu)與化學(xué)組分能夠充分模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。目前,由天然的與人工合成的聚合物組成的復(fù)合納米纖維能夠結(jié)合天然組分的生物學(xué)特性與人工聚合物的可降解行以及力學(xué)性質(zhì),作為一種新型納米結(jié)構(gòu)生物支架材料在組織工程領(lǐng)域中得到了廣泛的關(guān)注。在本論文中,首先,我們通過(guò)將無(wú)水相乳液乳化靜電紡絲技術(shù)一步法構(gòu)建基于天然蠶絲蛋白絲素蛋白(Silk fibroin,SF)與人工合成聚合物聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)功能性復(fù)合納米纖維支架,并進(jìn)行了系統(tǒng)的材料表征、藥物釋放與生物相容性的評(píng)估;第二,通過(guò)乳化靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了天然蠶絲蛋白絲膠蛋白(Silk sericin,SS)與PCL復(fù)合納米纖維并系統(tǒng)的驗(yàn)證了其體內(nèi)外生物相容性;最后,為了緩解靜電紡絲支架非特異性蛋白吸附與細(xì)胞侵潤(rùn)的局限性,我們通過(guò)乳化靜電紡絲構(gòu)建了一種抵抗蛋白吸附、多孔的透明質(zhì)酸(Hyaluronan,HA)/SF/PCL三元復(fù)合功能性納米纖維支架。主要的內(nèi)容與結(jié)果如下所列:①乳化靜電紡絲構(gòu)建SF/PCL“核-殼”結(jié)構(gòu)納米纖維與體外細(xì)胞相容性以及藥物釋放的研究我們通過(guò)無(wú)水相乳化電紡技術(shù)構(gòu)建了SF/PCL“核-殼”的納米纖維,使用掃描電鏡、透射電鏡、傅立葉紅外光譜、X射線衍射、示差熱量掃描、水接觸角以及力學(xué)拉伸測(cè)量等多種技術(shù)針對(duì)纖維的理化性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的表征,并解釋了SF/PCL乳化電紡所產(chǎn)生“核-殼”結(jié)構(gòu)的機(jī)制。異硫氰酸熒光素(FITC)體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估了“核-殼”結(jié)構(gòu)納米纖維藥物持續(xù)釋放的潛力。我們發(fā)現(xiàn)增加SF組分比例能夠增強(qiáng)整體纖維支架的親水性同時(shí)降低纖維直徑。通過(guò)甲醇處理后的SF/PCL納米纖維支架中SF構(gòu)象能夠從隨機(jī)卷曲模式向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,進(jìn)而促進(jìn)了納米纖維的結(jié)晶行為并增強(qiáng)了材料整體的力學(xué)拉伸強(qiáng)度。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估SF/PCL納米纖維作為組織工程支架的應(yīng)用潛力,結(jié)果證明混合材料能夠促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的粘附與增殖。我們的結(jié)果驗(yàn)證了單噴頭乳化電紡技術(shù)構(gòu)建的由天然蛋白SF與人工合成聚合物PCL“核-殼”結(jié)構(gòu)納米纖維的可行性,構(gòu)建的復(fù)合納米纖維支架具有持續(xù)的藥物釋放能力在組織工程領(lǐng)域中具有應(yīng)用潛力,在理論與技術(shù)上為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。②乳化靜電紡絲構(gòu)建SS/PCL復(fù)合納米纖維與體內(nèi)外生物相容性研究目前,SF蛋白應(yīng)用于生物材料設(shè)計(jì)是一個(gè)理想的選擇與途徑。然而,歸因于免疫排斥反應(yīng)、較弱的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與高水溶性,SS作為蠶絲的另一種天然蛋白組分在生物材料領(lǐng)域并沒(méi)有得到廣泛的關(guān)注。我們首次通過(guò)解剖五齡蠶中部腺體提取天然狀態(tài)下的SS蛋白進(jìn)行后續(xù)的靜電紡絲納米纖維材料的構(gòu)建與生物相容性的研究。為了提高SS蛋白的可紡性與材料結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,使用PCL與SS進(jìn)行混合并通過(guò)無(wú)水相乳化靜電紡絲技術(shù)成功構(gòu)建了納米纖維支架。SS/PCL支架通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡與傅立葉紅外光譜等多種技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的表征。力學(xué)拉伸測(cè)量與水接觸角實(shí)驗(yàn)揭示了SS/PCL混合支架相比較于純PCL支架能夠加強(qiáng)材料的力學(xué)性質(zhì)與親水性。我們也分析了在混合支架中的SS組分對(duì)人源皮膚成纖維細(xì)胞1至5天培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)與增殖情況的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SS/PCL組分在合適的比例下能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí)出現(xiàn)了更加伸展的細(xì)胞形態(tài)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)與I型膠原的m RNA基因水平在SS/PCL支架中的表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)。最后,體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示了SS/PCL支架相比較于純PCL支架具有較低的纖維化組織的形成以及較少的巨噬細(xì)胞粘附,意味著這種生物相容性支架在組織工程領(lǐng)域中具有應(yīng)用潛力。③乳化靜電紡絲構(gòu)建HA/SF/PCL三元復(fù)合納米纖維與非特異性蛋白吸附以及細(xì)胞侵潤(rùn)的功能性研究前文中通過(guò)混合天然SF與人工合成聚合物PCL制備靜電紡絲納米纖維支架材料具有結(jié)合力學(xué)、結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)性質(zhì)協(xié)同效用應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。然而,納米纖維結(jié)構(gòu)過(guò)高的比表面積與固有的過(guò)小孔徑能夠?qū)е麓罅康姆翘禺愋缘鞍孜�附與細(xì)胞難以侵潤(rùn)至材料內(nèi)部的局限性。因此,我們構(gòu)建了一種抵抗蛋白、多孔的納米纖維支架,是由HA、SF、與PCL三種聚合物溶液混合并通過(guò)乳化靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的三元復(fù)合納米纖維。我們對(duì)纖維支架的納米結(jié)構(gòu)、化學(xué)組分、力學(xué)性質(zhì)、親疏水性與蛋白吸附性等理化性質(zhì)進(jìn)行了表征與評(píng)估。溶脹與降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了在整體支架內(nèi)部定向孔結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生與纖維間孔徑的增大。添加HA組分能夠?qū)��?dāng)前的PCL/SF組分轉(zhuǎn)化為親水性的纖維,這種特性能夠抑制非特異性蛋白吸附,從而導(dǎo)致降低體內(nèi)纖維化組織的形成厚度與巨噬細(xì)胞的粘附。重要的是,PCL/SF/HA支架能夠明顯加強(qiáng)體外細(xì)胞侵潤(rùn)與體內(nèi)組織向材料內(nèi)部生長(zhǎng)。人源皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)在PCL/SF/HA納米纖維支架上表現(xiàn)出顯著性增強(qiáng)細(xì)胞的增殖情況與細(xì)胞絲狀偽足的產(chǎn)生,但是降低了I型膠原的表達(dá)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),HA與PCL/SF/HA支架能夠與細(xì)胞表面受體CD44相互作用激活TGF-β1/基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)信號(hào)通路進(jìn)而有助于細(xì)胞遷移。這些發(fā)現(xiàn)證明PCL/SF/HA復(fù)合納米纖維支架能夠抵抗蛋白吸附并加強(qiáng)細(xì)胞侵潤(rùn),為戰(zhàn)勝靜電紡絲技術(shù)的局限性提供了可能性。綜上所述,本論文針對(duì)目前生物材料支架的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)-靜電紡絲納米纖維所面臨的發(fā)展趨勢(shì),利用天然與人工合成高分子聚合物的無(wú)水相混合乳液通過(guò)靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建復(fù)合功能性納米纖維并驗(yàn)證了材料特性與生物學(xué)功能,能夠?yàn)樯�物材料的開發(fā)與應(yīng)用提供新的研究視角,對(duì)于組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究也具有一定的理論與實(shí)踐的參考價(jià)值。
【學(xué)位單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R318.08;TB383.1
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 緒論
    1.1 問(wèn)題的提出及研究意義
    1.2 靜電紡絲技術(shù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 靜電紡絲的基本原理
        1.2.2 靜電紡絲纖維的影響因素
        1.2.3 乳化靜電紡絲技術(shù)
    1.3 本課題的研究目的及內(nèi)容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究?jī)?nèi)容
        1.3.3 創(chuàng)新點(diǎn)
2 乳化靜電紡絲構(gòu)建SF/PCL“核-殼”結(jié)構(gòu)納米纖維與體外細(xì)胞相容性以及藥物釋放的研究
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.2.2 電紡溶液的制備
        2.2.3 靜電紡絲
        2.2.4 納米纖維支架的理化性質(zhì)表征
        2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.6 細(xì)胞形態(tài)
        2.2.7 細(xì)胞活性檢測(cè)
        2.2.8 FITC作為模式藥物的釋放行為檢測(cè)
        2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PCL/SF納米纖維的理化性質(zhì)
        2.3.2 細(xì)胞形態(tài)
        2.3.3 細(xì)胞活性
        2.3.4 FITC的藥物釋放行為
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 乳化靜電紡絲構(gòu)建SS/PCL復(fù)合納米纖維與體內(nèi)外生物相容性研究
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.2.2 電紡溶液的制備
        3.2.3 靜電紡絲
        3.2.4 納米纖維支架的理化性質(zhì)表征
        3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.6 細(xì)胞形態(tài)
        3.2.7 細(xì)胞活性檢測(cè)
        3.2.8 RNA提取與實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR
        3.2.9 動(dòng)物皮下移植
        3.2.10蘇木精/伊紅染色和免疫組化染色
        3.2.11統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 乳化電紡PCL/SS納米纖維支架
        3.3.2 PCL/SS納米纖維支架的材料組分與力學(xué)性質(zhì)
        3.3.3 體外FEK4成纖維細(xì)胞響應(yīng)PCL/SS支架：細(xì)胞形態(tài)與增殖情況
        3.3.4 細(xì)胞外基質(zhì)TGF-β1，I型膠原與III型膠原的表達(dá)情況
        3.3.5 體內(nèi)組織生物相容性
    3.4 小結(jié)
4 乳化靜電紡絲構(gòu)建HA/SF/PCL復(fù)合納米纖維與非特異性蛋白吸附以及細(xì)胞侵潤(rùn)的功能性研究
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.2.2 電紡溶液的制備
        4.2.3 靜電紡絲
        4.2.4 納米纖維支架的理化性質(zhì)表征
        4.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.6 細(xì)胞形態(tài)（CLSM與SEM）
        4.2.7 細(xì)胞活性檢測(cè)
        4.2.8 體外細(xì)胞侵潤(rùn)分析
        4.2.9 動(dòng)物皮下移植
        4.2.10 HE和免疫組化染色
        4.2.11功能蛋白表達(dá)分析
        4.2.12 RNA提取與實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR
        4.2.13統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 乳化靜電紡絲構(gòu)建PCL/SF/HA納米纖維支架：組分與納米結(jié)構(gòu)
        4.3.2 材料化學(xué)與力學(xué)特性：β-折疊結(jié)構(gòu)與力學(xué)強(qiáng)度
        4.3.3 溶脹與降解行為：定向大孔結(jié)構(gòu)產(chǎn)生與孔徑改變
        4.3.4 HA水合作用：材料親水性與蛋白吸附性質(zhì)
        4.3.5 體外FEK4成纖維細(xì)胞響應(yīng)：細(xì)胞形態(tài)，增殖與膠原蛋白表達(dá)
        4.3.6 體內(nèi)外生物相容性研究：細(xì)胞侵潤(rùn)與客體反應(yīng)
        4.3.7 HA與PCL/SF/HA纖維支架的生物化學(xué)功能：CD44，MMP-2，-9 以及TGF-β1的表達(dá)
    4.4 小結(jié)
5 主要結(jié)論與后續(xù)建議
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 后續(xù)建議
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    A. 在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文
    B. 在攻讀博士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目情況

【參考文獻(xiàn)】

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1 李海濱;李林昊;錢宇娜;蔡開勇;呂永鋼;鐘莉;劉萬(wàn)錢;楊力;;PCL/SS納米纖維支架的制備及相容性研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2011年02期

本文編號(hào)：2886132