發(fā)布時(shí)間：2020-10-29 13:49

　　 產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌,可引起人類和動(dòng)物的多種疾病。該菌主要引起人的氣性壞疽和食物中毒,被美國疾病控制和預(yù)防中心列為最常見的食源性疾病誘因。在家禽中,產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起壞死性腸炎——一種對全球家禽業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)影響的疾病——的關(guān)鍵病原體。IV型菌毛(Type IV pili,TFP)是一種由主要菌毛蛋白摻雜少量次要菌毛蛋白聚合而成的菌體表面纖維狀細(xì)絲。TFP介導(dǎo)細(xì)菌的多種功能,例如滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成、對宿主細(xì)胞的粘附及DNA攝取。其中,TFP依賴性的細(xì)胞粘附是產(chǎn)氣莢膜梭菌成功定植的第一步,缺乏TFP介導(dǎo)粘附能力的突變株對宿主細(xì)胞的粘附能力大幅降低。此外,在TFP的存在下,產(chǎn)氣莢膜梭菌可在宿主細(xì)胞表面形成生物被膜并增加毒素產(chǎn)生。產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O(Perfringolysin O,PFO)是一種膽固醇依賴性溶細(xì)胞素,存在于幾乎所有產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株之中。有研究表明,PFO在壞死性腸炎中與產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素具有協(xié)同作用,并且PFO介導(dǎo)的細(xì)胞毒性可能是產(chǎn)氣莢膜梭菌在宿主組織中得以存活的重要因素。因此,TFP及PFO有望成為抗產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的潛在藥物靶標(biāo)。在本研究中,我們首先以產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP介導(dǎo)的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)及PFO介導(dǎo)的溶血活性試驗(yàn)為篩選表型,從天然化合物中篩選并得到了能夠同時(shí)抑制TFP介導(dǎo)的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)及PFO介導(dǎo)的溶血活性的天然化合物——穗花杉雙黃酮。隨后,我們通過滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、生物被膜形成試驗(yàn)、最小抑菌濃度試驗(yàn)、生長曲線試驗(yàn)、細(xì)胞粘附試驗(yàn)詳細(xì)研究了穗花杉雙黃酮對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP生物學(xué)活性及粘附能力的影響,并在電子顯微鏡下觀察了穗花杉雙黃酮處理后菌體表面菌毛的形態(tài)。之后,我們通過溶血試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究了穗花杉雙黃酮對PFO生物學(xué)活性的影響,并通過分子模擬、點(diǎn)突變試驗(yàn)及寡聚化試驗(yàn)研究了穗花杉雙黃酮與PFO相互作用的分子機(jī)制。進(jìn)一步,在體內(nèi)試驗(yàn)中,我們通過小鼠腿部感染產(chǎn)氣莢膜梭菌建立了小鼠氣性壞疽模型,檢測了穗花杉雙黃酮對感染小鼠死亡率、組織中細(xì)菌存活率及組織損傷的影響。最后,我們通過對肉雞感染產(chǎn)氣莢膜梭菌建立了壞死性腸炎模型,通過肉雞腸道脹氣情況、出血情況、糞便情況等指標(biāo)檢測了穗花杉雙黃酮對壞死性腸炎的治療效果,并檢測了穗花杉雙黃酮對肉雞腸道內(nèi)梭菌目相對豐度的影響。我們的結(jié)果表明:第一,穗花杉雙黃酮對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP介導(dǎo)的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)及PFO介導(dǎo)的溶血活性具有顯著的抑制作用。第二,穗花杉雙黃酮在4或16μg/mL的濃度下對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP依賴性的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)、生物被膜的形成及粘附至Caco-2細(xì)胞能力具有顯著的抑制作用,且這一作用不是通過抑菌或殺菌活性實(shí)現(xiàn)的。電子顯微鏡下觀察,我們發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮處理后導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體表面菌毛缺失,說明穗花杉雙黃酮是一種潛在的TFP抑制劑。第三,穗花杉雙黃酮在2或4μg/mL的濃度下可顯著抑制PFO介導(dǎo)的溶血活性和對Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性,S190、S193、N199、V375及N377是穗花杉雙黃酮與PFO相互作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),對關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行點(diǎn)突變后,穗花杉雙黃酮對PFO介導(dǎo)溶血活性的抑制作用顯著下降。在寡聚化試驗(yàn)中,穗花杉雙黃酮能夠抑制PFO的寡聚化過程。第四,在小鼠氣性壞疽感染模型中,穗花杉雙黃酮可以延長感染小鼠的存活時(shí)間,降低感染小鼠組織內(nèi)的細(xì)菌存活率,有效地減輕了病理損傷。第五,在肉雞壞死性腸炎模型中,我們發(fā)現(xiàn)通過給予穗花杉雙黃酮可以有效緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎引起的腸道脹氣、腸壁出血等病理性損傷,并能夠降低腸道內(nèi)厚壁菌門、梭菌綱及梭菌目的相對豐度�？傊�,我們的結(jié)果表明穗花杉雙黃酮是一種潛在的TFP抑制劑,其處理后導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體表面TFP缺失,進(jìn)而顯著降低其對宿主細(xì)胞的粘附能力。同時(shí),穗花杉雙黃酮也是一種PFO抑制劑,可通過靶向PFO的關(guān)鍵氨基酸殘基,抑制PFO的寡聚化,從而顯著抑制PFO介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。由于TFP及PFO介導(dǎo)的毒力對于病原菌的致病力具有決定性作用,穗花杉雙黃酮對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的氣性壞疽及壞死性腸炎具有良好的保護(hù)作用,具有進(jìn)一步研發(fā)的潛力。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

革蘭氏陽性菌中TFP關(guān)鍵組分示意圖如圖2.1所示,其中關(guān)鍵的組分主要有主要菌毛蛋白PilA、負(fù)責(zé)組裝功能的ATP酶PilB、內(nèi)膜核心蛋白PilC、用于修飾菌毛前體蛋白的轉(zhuǎn)肽酶PilD及負(fù)責(zé)收縮菌毛的ATP酶PilT[106]�？梢�,TFP骨架是由數(shù)千個(gè)分子的PilA螺旋形排列聚合而成的大分子蛋白多聚體。PilA首先在菌體內(nèi)合成具有信號(hào)肽的菌毛前體,該信號(hào)肽富含堿性氨基酸殘基并且在切割位點(diǎn)之前的1位氨基酸殘基通常為甘氨酸。TFP分為兩個(gè)亞型,IVa型的菌毛蛋白信號(hào)肽具有5至7個(gè)氨基酸殘基,以苯丙氨酸作為成熟蛋白的1位氨基酸殘基,而IVb型的菌毛蛋白具有更長的信號(hào)肽(最多26個(gè)氨基酸殘基)并且在成熟時(shí)以除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸殘基作為N端。菌毛前體蛋白通過Sec途徑分泌系統(tǒng)穿過內(nèi)膜,在內(nèi)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè),信號(hào)肽序列被專門負(fù)責(zé)修飾菌毛前體蛋白的膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶PilD識(shí)別并在保守的-1位的甘氨酸及1位的苯丙氨酸(或除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸殘基)之間進(jìn)行裁切以切除信號(hào)肽序列,之后經(jīng)過N端修飾,將菌毛前體蛋白加工為成熟的菌毛蛋白PilA[107-109]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的pilT基因并不位于主要或次要TFP操縱子區(qū)(圖2.2C),其與艱難梭菌的PilT氨基酸序列同一性達(dá)56%,與銅綠假單胞菌PilT的同一性為50%[112]。有研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌pilT突變株不能夠形成TFP,菌體表現(xiàn)為無可觀測到的菌毛狀態(tài),說明pilT對于形成完整的菌毛至關(guān)重要[106]。除主要菌毛蛋白外,細(xì)菌還會(huì)表達(dá)少量次要菌毛蛋白,粘附于TFP骨架尖端[113],次要菌毛蛋白與主要菌毛蛋白具有N末端序列同源性,說明次要菌毛蛋白可能源自于主要菌毛蛋白的一部分,目前的研究表明次要菌毛蛋白負(fù)責(zé)優(yōu)化菌毛骨架的組裝或收縮,影響菌毛功能[114-118]。

對于TFP的詳細(xì)裝配過程目前尚未完全研究透徹,最為廣泛的被學(xué)界認(rèn)同的一種裝配模型如圖2.3所示。在菌毛裝配的過程中,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的PilA穿過內(nèi)膜層,募集到裝配部位,由其帶負(fù)電荷的第5位谷氨酸殘基(圖2.3中紅色-)和帶正電荷的N端1位的苯丙氨酸(或除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸殘基)氨基酸殘基(圖2.3中藍(lán)色+)之間的電荷互補(bǔ)吸引至正在裝配的PilA基底部。PilB位于胞質(zhì)中,通過結(jié)合ATP,ATP酶PilB發(fā)生構(gòu)象變化,通過推動(dòng)內(nèi)膜核心蛋白,將PilC向細(xì)胞膜外側(cè)推動(dòng)一小段距離(約8-10?),PilC作為杠桿,進(jìn)一步推動(dòng)募集在裝配區(qū)域的PilA基底部,在菌毛基底部周圍開放一個(gè)新的間隙,用于新的PilA進(jìn)入裝配部位。PilB水解ATP后,恢復(fù)原有的空間構(gòu)象,之后重復(fù)循環(huán),依次將PilA添加到TFP骨架基底部,最終由數(shù)千個(gè)分子的PilA螺旋形排列聚合而成完整的TFP骨架[119-123]。最后,管家分選酶將TFP骨架基底部連接到細(xì)胞壁肽聚糖的氨基,完成TFP骨架的全部裝配及錨定至細(xì)胞表面的過程[101]。對于TFP的收縮,可能與其組裝過程相反,并涉及收縮菌毛的ATP酶PilT,PilT誘導(dǎo)菌毛分解的機(jī)制尚不清楚,但對于單個(gè)PilT,用于菌毛收縮過程產(chǎn)生的收縮力經(jīng)測量可>100 pN,是目前為止發(fā)現(xiàn)的作用力最強(qiáng)的生物馬達(dá),這一強(qiáng)大的收縮力結(jié)合PilB產(chǎn)生的推動(dòng)力賦予了TFP伸縮運(yùn)動(dòng)的能力,進(jìn)而使得表達(dá)上述菌毛相關(guān)蛋白的細(xì)菌具有了TFP依賴的運(yùn)動(dòng)性[124-126]。
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