金屬脅迫下中華稻蝗金屬硫蛋白分子特性及功能研究
發(fā)布時間：2020-11-04 11:56
快速發(fā)展的工業(yè)化和城市化導(dǎo)致重金屬的污染日益嚴重,這關(guān)系到人類健康和環(huán)境安全。被重金屬污染的土壤和水體可通過農(nóng)業(yè)灌溉進入食物鏈并轉(zhuǎn)移到植物和動物體內(nèi)。水稻是我國種植面積最廣的糧食作物,稻田是目前重金屬污染最為嚴重的農(nóng)業(yè)區(qū)域。金屬硫蛋白(Metallothionein MT),是一類金屬結(jié)合蛋白。自1957年首次在馬腎中發(fā)現(xiàn)以來,研究者們陸續(xù)在不同生物類群中展開了對MT的研究,所涉及的領(lǐng)域包括生命科學(xué)、物理化學(xué)、應(yīng)用醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等。MT是細胞內(nèi)一類低分子量、高半胱氨酸含量的蛋白分子,對具有10個電子的金屬具有極高的親和力,包括必需金屬(鋅和銅等)和非必需微量元素(鎘和汞等)。MT普遍存在于微生物、植物、動物以及人類細胞中,在金屬代謝中起著重要的作用。近年來,對昆蟲MT的研究僅限于果蠅、土壤跳蟲、蚊蟲等少數(shù)物種,目前很少見對農(nóng)業(yè)害蟲MT分子特性及功能方面的系統(tǒng)研究。中華稻蝗(Oxya chinensis, O. chinensis)是以水稻葉片和莖桿為食的重要農(nóng)業(yè)害蟲,重金屬可通過中華稻蝗取食富集重金屬的水稻植株后在蟲體內(nèi)不同組織中蓄積。本文以重金屬鎘、銅和鋅為脅迫誘導(dǎo)因子,研究重金屬作用下中華稻蝗金屬硫蛋白基因(Oxya chinensis Metallothionein, OcMT)的分子特性和功能以及對中華稻蝗解毒酶系和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。本文通過深入開展以上研究,對闡明中華稻蝗金屬硫蛋白基因功能和重金屬解毒機制具有重要意義。本文主要內(nèi)容如下：1、中華稻蝗金屬硫蛋白的分子特性分析基于中華稻蝗經(jīng)重金屬鎘染毒后構(gòu)建的數(shù)字基因表達譜,采用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析得到2個OcMT基因(OcMT1和iOcMT2)的全長序列。已知OcMT1分子全長552 bp,開放閱讀框為123 bp,編碼40個氨基酸殘基；OcMT2分子全長363 bp,開放閱讀框為195 bp,編碼64個氨基酸殘基；將這2個MT基因序列與目前已知的其他昆蟲MT序列進行比對和分析,發(fā)現(xiàn)OcMTl和OcMT2具有與其他物種MT蛋白類似的氨基酸特征,半胱氨酸(Cys)含量分別為22.5%和25%,這些半胱氨酸在氨基酸分子中以Cys-Cys, Cys-X-Cys, Cys-X-Y-Cys或Cys-X-Y-Z-Cys的結(jié)構(gòu)式存在,這樣的分子組成和特征使半胱氨酸的巰基容易與金屬離子結(jié)合形成M-MT復(fù)合物。2、中華稻蝗金屬硫蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄特性分析采用RT-qPCR技術(shù)檢測了金屬硫蛋白基因在中華稻蝗不同發(fā)育階段和不同組織部位RNA轉(zhuǎn)錄表達特性,結(jié)果表明：OcMT1和OcMT2均在中華稻蝗卵期轉(zhuǎn)錄水平最高,而在孵化后的整個發(fā)育時期穩(wěn)定表達,且轉(zhuǎn)錄表達量較卵期低；OcMTl和OcMT2具有不同的組織分布,OcMT1在視葉中表達最高,而OcMT2在腦中高表達,其次是脂肪體,表明中華稻蝗2個OcMT基因在生理功能具有差異性。3、中華稻蝗金屬硫蛋白基因和蛋白功能研究利用RNA干擾技術(shù)進一步從分子水平研究了OcMT1和Oc. MT2的功能,中華稻蝗注射雙鏈RNA (dsRNA)48 h后,用不同濃度的3種金屬處理試蟲,結(jié)果表明：OcMT1和OcMT2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達量在63.1-70.9%的有效沉默時,金屬毒性導(dǎo)致試蟲死亡率增加8.5-16.7%；異源表達OcMT1和OcMT2蛋白的大腸桿菌在含銅培養(yǎng)基的生長測試實驗表明,OcMT1和OcMT2蛋白可增強宿主細菌對銅的耐受性；采用熒光光譜法檢測OcM T1和OcMT2蛋白對不同金屬的結(jié)合能力,結(jié)果表明,異源表達OcMT1和OcMT2蛋白均可螯合鎘、銅和鋅3種金屬,且OcMT1與鋅的結(jié)合能力最強,()cMT2與銅的結(jié)合能力最強。4、重金屬對中華稻蝗解毒酶活性和組織形態(tài)的影響慢性鎘染毒后中華稻蝗體內(nèi)磷酸酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等解毒酶活性普遍上升；鎘毒性可導(dǎo)致中腸、胃盲囊、馬氏管以及圍食膜組織結(jié)構(gòu)嚴重受損；慢性鎘染毒后中華稻蝗不同類型血細胞形態(tài)和組成發(fā)生變化；中華稻蝗經(jīng)鎘、銅、鋅急性染毒后,發(fā)現(xiàn)蟲體脂肪體的脂肪滴直徑變小；馬氏管內(nèi)均出現(xiàn)不同形態(tài)的顆粒物質(zhì)。結(jié)果表明,中華稻蝗相關(guān)組織通過不同形式參與重金屬的解毒,對降低重金屬毒性,保護蟲體發(fā)揮重要的作用。綜上所述,本文通過對重金屬脅迫下中華稻蝗金屬硫蛋白基因、蛋白、組織形態(tài)和解毒酶變化等系列研究,揭示在重金屬脅迫下蟲體基因水平、蛋白水平以及組織學(xué)水平的適應(yīng)性變化規(guī)律。研究結(jié)果對昆蟲重金屬解毒機制研究具有一定的理論意義,同時也為檢測和評估農(nóng)業(yè)環(huán)境中重金屬的污染和危害提供實踐依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X174;S435.112.4
【部分圖文】：
１９５７年作為錫結(jié)合蛋白被Ｖａｌｌｅｅ和Ｍａｒｇｏｓｈｅｓ在馬腎中發(fā)現(xiàn)由于其分子中富??半脫氨酸且容易與重金屬離子結(jié)合，因此被命名為金屬硫蛋白１４＼科學(xué)家陸續(xù)在??不同的物種中進行了大量的研究和探討后發(fā)現(xiàn)其存在于細菌、植物、無脊椎動物和??脊椎動物等幾乎所有的生物體內(nèi)１ＷＷ。因其分子中含有較多數(shù)量的半腕氨酸殘基，使??其分子有較高的硫含量且對重金屬具有較高的親和力。ＭＴ分子中所含有的半化氨酸??在絕大多數(shù)生物體ＭＴ中是高度保守的，這些半腕氨酸殘基通常配位鍵形成??Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓ的排列方式（Ｘａａ是除半脫氨酸Ｗ外的其他氨基酸），其中Ｘ和Ｙ多為??Ｓｅｒ或Ｔｈｒ，其次為Ａｒｇ和Ｌｙｓ。盡管金屬硫蛋白具有一些共有的性質(zhì)和特點，但來??自不同物種的ＭＴ蛋白質(zhì)的大小和氨基酸組成差別很大，甚至同一物種的不同亞型??間其組成也不盡不同。目前研究最多且較為清楚的是人類ＭＴ，人類ＭＴ位于第１６??號染色體且分為４個類型（ｉＷ７，?和Ａ／７Ｖ），Ｍ７和在全身表達，??特異性的表達于腦，ｉｌ／風(fēng)則只發(fā)現(xiàn)存在于復(fù)層鱗狀上皮【＂１。??１．２．１金屬硫蛋白的特點??
有樣品中表達量最化的樣品的表達量為１，其他各個樣品的ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄表達??１的倍數(shù)，用相對表達水平表征。所有實驗結(jié)果分析后Ｗ平均數(shù)±標準誤表示，??用Ｔｕｋｅｙ＇ｓ?ＨＳＤ法（ＳＰＳＳ）對實驗結(jié)果進行分析�；蛳鄬Ρ磉_量柱形圖上??不同字母代表基因表達具有顯著性差異（尸＜化〇５），不同數(shù)據(jù)間沒有顯著性??用相同字母代表。??驗結(jié)果??華稻惶金屬硫蛋白基因的驗證??研究在前期工作基礎(chǔ)上，采用重金屬領(lǐng)慢性染毒處理中華稻幢后，構(gòu)建數(shù)字??達譜，分析差異基因表達情況。結(jié)果表明，領(lǐng)慢性染毒后有巧９個基因上調(diào)表??調(diào)表達基因有１８９個，其中２個ＯｃＭＴ基因分別上調(diào)表達２７９倍和４８３倍。初步分??個ＯｃＭＴ基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能與重金屬領(lǐng)處理中華稻幢有關(guān)。將２個ＯｃＭＴ基因??Ａ序列輸入Ｇｅｎｂａｎｋ數(shù)據(jù)庫進行Ｂｌａｓｔ分析，并與其他已知昆蟲ＭＴ氨基酸序列進??，初步判斷２個基因可能為中華稻幢ＯｃＭＴ基因，因此進行了驗證和分析。??Ｍａｒｋｅｒ??
ＡＥＯ５０６９９），?岡比亞按蚊：如０ｐ片ｅ／ｅ■ｓ各ｆｌ７Ｋ６／口ｅ（＾ｇＡ／７７：ＡＡＸ８６ＯＯ６，／＾各Ａ／７２：ＡＡＸ８６ＯＯ７），搖蚊：Ｃ／Ｈ＇ｒａＫ〇／Ｋｗ／＊ｚ）！Ｗ７７Ｍｓ??（ＯＭＴ：ＡＤ巧４１６３），姚妃：描６幻ｍｗｙ口ｏ（Ａｆ７７Ｗ：ＡＢＸ８００７８，Ａ／７７｝＾ＡＡＸ８６０Ｃｒ７９）。??由圖２．４可見，中華稻幢２個ＭＴ氨基酸（ＯｃＭＴｌ和ＯｃＭＣ）與其他昆蟲ＭＴ??的進化關(guān)系分析顯示，ＯｃＭＴｌ與家蝸ＭＴ１?Ｗ及黒腹果禍ＭＴＡ聚為一支，而ＯｃＭＴ２??與此的ＭＴＴｙ２聚為另一支。??２．３．２中華稻幢金屬硫蛋白基因序列的分析??將２個ＯｃＭＴ基因ｃＤＮＡ全長序列提交ＮＣＢＩ官方網(wǎng)站，并獲得ＧｅｎＢａ址注釋??號分別為：ＫＪ１５３０１４和ＫＪ１５３０１５。這２個ＯｃＭＴ基因具有完整結(jié)構(gòu)，包括起始密??碼子ＡＴＧ，終止密碼子ＴＧＡ和ＰＩｏｙＡ尾（ＡＡＴＡＡＡ）。ＯｃＭ？７全長為５５２?ｂｐ，其開??放閱讀框為１２３ｂｐ，編碼４０個氨基酸，其蛋白的理論分子大小為３．７４?ＫＤａ，等電點??為?８．１１，分子中含有?１?個?Ｃｙｓ－Ｃｙｓ?三個?Ｃｙｓ－Ｘ－Ｃｙｓ?結(jié)構(gòu)（ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＫＣＸ??－ＸＸＣＴＣＴＮＣＡＣ）；?ＯＣＭＴ２全長為３６３?ｂｐ
本文編號：2870066
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X174;S435.112.4
【部分圖文】：
１９５７年作為錫結(jié)合蛋白被Ｖａｌｌｅｅ和Ｍａｒｇｏｓｈｅｓ在馬腎中發(fā)現(xiàn)由于其分子中富??半脫氨酸且容易與重金屬離子結(jié)合，因此被命名為金屬硫蛋白１４＼科學(xué)家陸續(xù)在??不同的物種中進行了大量的研究和探討后發(fā)現(xiàn)其存在于細菌、植物、無脊椎動物和??脊椎動物等幾乎所有的生物體內(nèi)１ＷＷ。因其分子中含有較多數(shù)量的半腕氨酸殘基，使??其分子有較高的硫含量且對重金屬具有較高的親和力。ＭＴ分子中所含有的半化氨酸??在絕大多數(shù)生物體ＭＴ中是高度保守的，這些半腕氨酸殘基通常配位鍵形成??Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓ的排列方式（Ｘａａ是除半脫氨酸Ｗ外的其他氨基酸），其中Ｘ和Ｙ多為??Ｓｅｒ或Ｔｈｒ，其次為Ａｒｇ和Ｌｙｓ。盡管金屬硫蛋白具有一些共有的性質(zhì)和特點，但來??自不同物種的ＭＴ蛋白質(zhì)的大小和氨基酸組成差別很大，甚至同一物種的不同亞型??間其組成也不盡不同。目前研究最多且較為清楚的是人類ＭＴ，人類ＭＴ位于第１６??號染色體且分為４個類型（ｉＷ７，?和Ａ／７Ｖ），Ｍ７和在全身表達，??特異性的表達于腦，ｉｌ／風(fēng)則只發(fā)現(xiàn)存在于復(fù)層鱗狀上皮【＂１。??１．２．１金屬硫蛋白的特點??
有樣品中表達量最化的樣品的表達量為１，其他各個樣品的ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄表達??１的倍數(shù)，用相對表達水平表征。所有實驗結(jié)果分析后Ｗ平均數(shù)±標準誤表示，??用Ｔｕｋｅｙ＇ｓ?ＨＳＤ法（ＳＰＳＳ）對實驗結(jié)果進行分析�；蛳鄬Ρ磉_量柱形圖上??不同字母代表基因表達具有顯著性差異（尸＜化〇５），不同數(shù)據(jù)間沒有顯著性??用相同字母代表。??驗結(jié)果??華稻惶金屬硫蛋白基因的驗證??研究在前期工作基礎(chǔ)上，采用重金屬領(lǐng)慢性染毒處理中華稻幢后，構(gòu)建數(shù)字??達譜，分析差異基因表達情況。結(jié)果表明，領(lǐng)慢性染毒后有巧９個基因上調(diào)表??調(diào)表達基因有１８９個，其中２個ＯｃＭＴ基因分別上調(diào)表達２７９倍和４８３倍。初步分??個ＯｃＭＴ基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能與重金屬領(lǐng)處理中華稻幢有關(guān)。將２個ＯｃＭＴ基因??Ａ序列輸入Ｇｅｎｂａｎｋ數(shù)據(jù)庫進行Ｂｌａｓｔ分析，并與其他已知昆蟲ＭＴ氨基酸序列進??，初步判斷２個基因可能為中華稻幢ＯｃＭＴ基因，因此進行了驗證和分析。??Ｍａｒｋｅｒ??
ＡＥＯ５０６９９），?岡比亞按蚊：如０ｐ片ｅ／ｅ■ｓ各ｆｌ７Ｋ６／口ｅ（＾ｇＡ／７７：ＡＡＸ８６ＯＯ６，／＾各Ａ／７２：ＡＡＸ８６ＯＯ７），搖蚊：Ｃ／Ｈ＇ｒａＫ〇／Ｋｗ／＊ｚ）！Ｗ７７Ｍｓ??（ＯＭＴ：ＡＤ巧４１６３），姚妃：描６幻ｍｗｙ口ｏ（Ａｆ７７Ｗ：ＡＢＸ８００７８，Ａ／７７｝＾ＡＡＸ８６０Ｃｒ７９）。??由圖２．４可見，中華稻幢２個ＭＴ氨基酸（ＯｃＭＴｌ和ＯｃＭＣ）與其他昆蟲ＭＴ??的進化關(guān)系分析顯示，ＯｃＭＴｌ與家蝸ＭＴ１?Ｗ及黒腹果禍ＭＴＡ聚為一支，而ＯｃＭＴ２??與此的ＭＴＴｙ２聚為另一支。??２．３．２中華稻幢金屬硫蛋白基因序列的分析??將２個ＯｃＭＴ基因ｃＤＮＡ全長序列提交ＮＣＢＩ官方網(wǎng)站，并獲得ＧｅｎＢａ址注釋??號分別為：ＫＪ１５３０１４和ＫＪ１５３０１５。這２個ＯｃＭＴ基因具有完整結(jié)構(gòu)，包括起始密??碼子ＡＴＧ，終止密碼子ＴＧＡ和ＰＩｏｙＡ尾（ＡＡＴＡＡＡ）。ＯｃＭ？７全長為５５２?ｂｐ，其開??放閱讀框為１２３ｂｐ，編碼４０個氨基酸，其蛋白的理論分子大小為３．７４?ＫＤａ，等電點??為?８．１１，分子中含有?１?個?Ｃｙｓ－Ｃｙｓ?三個?Ｃｙｓ－Ｘ－Ｃｙｓ?結(jié)構(gòu)（ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＫＣＸ??－ＸＸＣＴＣＴＮＣＡＣ）；?ＯＣＭＴ２全長為３６３?ｂｐ
本文編號：2870066
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