發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 17:23

　　 當(dāng)真核細(xì)胞面臨逆境條件時(shí),細(xì)胞內(nèi)會形成由m RNA結(jié)合且體積較大的細(xì)胞質(zhì)顆粒物、核糖體元件和包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白。在這些顆粒物形成的同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的m RNA暫時(shí)保持沉默,使細(xì)胞的能量集中在轉(zhuǎn)錄與生存相關(guān)的蛋白。在逆境下因細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中斷而合成的顆粒物可以被降解,當(dāng)環(huán)境條件得到改善時(shí)重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在這些顆粒物中,有兩種蛋白組分不同的RNA顆粒被區(qū)分開來:應(yīng)激顆粒(Stress Granules),或稱應(yīng)力顆粒,及過程產(chǎn)物P小體(Processing Bodies)。其中P小體的體積較小,形狀規(guī)則,常態(tài)時(shí)在細(xì)胞中亦有分布。應(yīng)激顆粒是本課題主要的研究對象,它具有較大且不規(guī)則的形狀,由不翻譯的信使核糖核蛋白顆粒(messenger ribonucleo protein particle,m RNP)組成,其組裝是由各種環(huán)境壓力引發(fā)的,包括熱激,碳匱乏,過氧化,高滲透壓,病毒感染,紫外線照射等,但不包括X射線照射和DNA損傷劑逆境。形成RNA的細(xì)胞質(zhì)顆粒的能力是細(xì)胞在壓力下生存的重要條件,也是打破自身凋亡和生存之間平衡的重要條件。對應(yīng)激顆粒形成相關(guān)基因及作用規(guī)律的研究,在對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)的應(yīng)激能力提供了分子層面的解釋的同時(shí),對于其他真核細(xì)胞在逆境下的存亡選擇依據(jù)和哺乳動物中癌細(xì)胞的形成機(jī)制也具有參考意義。至今,釀酒酵母(S.cerevisiae)中應(yīng)激顆粒的具體成分、形成條件以及逆境激活信號通路的調(diào)控機(jī)制等問題尚不為人所知,說明上述機(jī)制正是本課題研究的目的。釀酒酵母(S.cerevisiae)的全基因組測序已完成,而自動化的合成遺傳陣列(Synthetic Genetic Array,SGA)分析技術(shù)和基因組水平的高通量的成像篩選技術(shù)也已經(jīng)研制成功�；�于上述技術(shù)條件,本研究將帶有紅色熒光蛋白的應(yīng)激顆粒標(biāo)記物PAB1-RFP轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(S.cerevisiae)基因組中,再通過SGA的融合技術(shù),對帶有PAB1-RFP標(biāo)記的4600株單基因敲除突變子和800株溫度敏感型突變子進(jìn)行應(yīng)激顆粒的逆境誘導(dǎo),主要以脫氧葡萄糖處理為逆境條件,基于應(yīng)激顆粒豐度,篩選出與野生型差別較大的突變子,分析這些突變子缺失基因的功能與應(yīng)激顆粒組裝和分解之間的聯(lián)系,以此探明細(xì)胞在應(yīng)激顆粒形成過程中涉及的生物代謝途徑。通過大規(guī)模篩選,發(fā)現(xiàn)了許多與應(yīng)激顆粒形成相關(guān)的功能基因。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)應(yīng)激顆粒形成所需基因集中在:胞內(nèi)體組分、核糖體組分、GARP復(fù)合物、EGO-GSE復(fù)合物和蛋白質(zhì)折疊。而導(dǎo)致應(yīng)激顆粒異常增多的缺失基因多與生物體膜結(jié)構(gòu)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以及自噬作用相關(guān),作用于應(yīng)激顆粒的分解。大多數(shù)表型突出的陰性突變子在面臨其他逆境條件時(shí),如熱激、高滲透壓,仍然難以形成應(yīng)激顆粒,但有一部分突變子的陰性表型是針對特定的逆境條件的。那些缺失后致使應(yīng)激顆粒無法形成的蛋白,大多集中在低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)區(qū)域,說明很多非緊密結(jié)合的大分子與應(yīng)激顆粒的結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)。熱激能在誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成的同時(shí)提高芽殖酵母的突變頻率,一些應(yīng)激顆粒形成困難的突變子在熱激中顯示出更高的突變率,而這種特性僅存在于熱激逆境下。篩選結(jié)果中的幾個(gè)影響應(yīng)激顆粒形成的突變會影響到Ran GTP酶和TOR代謝通路,調(diào)控RNA和蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸。在應(yīng)激顆粒形成困難的突變子中,逆境調(diào)控的信號蛋白的轉(zhuǎn)錄達(dá)到了極端的程度:逆境誘導(dǎo)的m RNA積累的比野生型更多,然而被逆境抑制的m RNA在這些突變子中也更為劇烈的減少。這些結(jié)果說明應(yīng)激顆粒不僅被PKA,HOG等逆境信號通路所調(diào)控,并且它也能調(diào)節(jié)逆境反應(yīng)的程度。據(jù)推斷,RNA結(jié)合蛋白的往復(fù)的核質(zhì)運(yùn)動負(fù)責(zé)逆境中的基因表達(dá)調(diào)控,應(yīng)激顆粒正是這種核質(zhì)運(yùn)動的調(diào)控者。逆境下應(yīng)激顆粒組裝能力強(qiáng)的細(xì)胞有生殖能力和適應(yīng)能力更強(qiáng)的傾向。反之,應(yīng)激顆粒的缺失可能導(dǎo)致逆境條件下細(xì)胞出現(xiàn)過度的有害反應(yīng)。應(yīng)激顆粒的組裝可能是細(xì)胞對疊加逆境的應(yīng)激反應(yīng)減弱的原因之一。此外,本課題還對釀酒酵母(S.cerevisiae)細(xì)胞在衰老過程中產(chǎn)生的損傷蛋白聚集體和應(yīng)激顆粒進(jìn)行了對比分析,首先觀察到這兩者之間并不存在共定位關(guān)系,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老可以誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成,而在其他逆境下衰老細(xì)胞應(yīng)激顆粒的合成被抑制。與應(yīng)激顆粒相似的是,非逆境條件下衰老細(xì)胞的蛋白聚集體豐度高于新生細(xì)胞,但逆境下新生細(xì)胞中的蛋白聚集體形成率高于衰老細(xì)胞,說明細(xì)胞衰老對逆境下的蛋白聚集體組裝有抑制作用。
【學(xué)位單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q933
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 研究的目的和意義
    1.2 國內(nèi)外研究綜述
        1.2.1 釀酒酵母的合成遺傳陣列技術(shù)
        1.2.2 RNA顆粒簡介
    1.3 目前存在的主要問題
    1.4 本文的主要研究內(nèi)容
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基相關(guān)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與用途
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 質(zhì)詢菌株的構(gòu)建
        2.2.2 構(gòu)建PAB1-RFP單基因敲除陣列
        2.2.3 應(yīng)激顆粒形成相關(guān)基因的大規(guī)模篩選
        2.2.4 篩選結(jié)果的驗(yàn)證
        2.2.5 缺失基因的補(bǔ)回驗(yàn)證
        2.2.6 熒光顯微鏡成像
        2.2.7 遺傳圖譜的構(gòu)建
        2.2.8 生物信息學(xué)分析
        2.2.9 酵母恢復(fù)生長曲線
        2.2.10 逆境后細(xì)胞存活率的測量
        2.2.11 CAN1基因突變頻率的測定
        2.2.12 應(yīng)激性信號蛋白和基因表達(dá)水平定量分析
        2.2.13 Western雜交
        2.2.14 酵母菌滴測試
        2.2.15 釀酒酵母世代數(shù)的測定
        2.2.16 衰老細(xì)胞的分離純化
        2.2.17 細(xì)胞壁芽痕染色
        2.2.18 多聚核糖體含量分析
第3章 應(yīng)激顆粒形成相關(guān)基因的大規(guī)模篩選
    3.1 引言
    3.2 熒光標(biāo)記應(yīng)激顆粒組成蛋白PAB1
        3.2.1 應(yīng)激顆粒組成蛋白Pab1
        3.2.2 PAB1-RFP質(zhì)詢菌株的構(gòu)建
        3.2.3 PAB1-RFP在釀酒酵母細(xì)胞中的表型
    3.3 標(biāo)記菌株與釀酒酵母基因組單敲除文庫的融合
    3.4 應(yīng)激顆粒表型的評價(jià)和最適誘導(dǎo)條件的摸索
        3.4.1 應(yīng)激顆粒表型的評價(jià)方法
        3.4.2 大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn)條件探索
    3.5 基于應(yīng)激顆粒表型的大規(guī)模篩選結(jié)果
        3.5.1 應(yīng)激顆粒的候選陽性與陰性突變子
        3.5.2 候選突變子的檢驗(yàn)
    3.6 本章小結(jié)
第4章 應(yīng)激顆粒形成相關(guān)基因的代謝功能分析
    4.1 引言
    4.2 促進(jìn)應(yīng)激顆粒形成的基因功能分布概況
    4.3 轉(zhuǎn)錄翻譯和RNA代謝對應(yīng)激顆粒的影響
    4.4 蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)��?yīng)激顆粒的影響
    4.5 細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)對應(yīng)激顆粒的影響
    4.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用對應(yīng)激顆粒的影響
    4.7 本章小結(jié)
第5章 應(yīng)激顆粒對釀酒酵母的生理影響及作用規(guī)律
    5.1 引言
    5.2 不同逆境對應(yīng)激顆粒與DNA突變率的影響
        5.2.1 不同逆境引發(fā)不同的應(yīng)激顆粒發(fā)生率
        5.2.2 逆境下應(yīng)激顆粒陰性突變子的DNA突變率變化
    5.3 應(yīng)激顆粒陰性突變子中的信號蛋白表達(dá)變化
    5.4 應(yīng)激顆粒與細(xì)胞衰老
        5.4.1 應(yīng)激顆粒陰性突變子的世代壽命
        5.4.2 衰老細(xì)胞中的應(yīng)激顆粒表型
        5.4.3 RNA顆粒與損傷蛋白聚集體
    5.5 RNA顆粒的形成機(jī)理
        5.5.1 mRNP去向決定m RNA命運(yùn)
        5.5.2 逆境的啟動和終止
    5.6 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果
致謝
個(gè)人簡歷

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