發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 15:03

　　 全球海洋中有豐富的藻類。海藻多糖可以為海洋中的異養(yǎng)細(xì)菌提供碳源。海洋藻類多糖種類豐富,包括紅藻中的瓊膠、卡拉膠,褐藻中的褐藻膠及綠藻中的石莼多糖和阿拉伯半乳聚糖。褐藻酸是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)兩種單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的褐藻多糖。根據(jù)褐藻酸分子中單體的排列順序分為聚甘露糖醛酸片段(PM)、聚古羅糖醛酸片段(PG)和甘露糖醛酸-古羅糖醛酸雜合片段(PMG)。褐藻膠可以應(yīng)用于食品,醫(yī)藥和生物材料領(lǐng)域,褐藻膠裂解酶在生物技術(shù)領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用。褐藻酸裂解酶通過β-消除機(jī)制裂解褐藻酸單體間的β-1,4糖苷鍵。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻酸裂解酶分布于多糖裂解酶 PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL32、PL34 和 PL36 這 10個(gè)家族中。PL36家族是一個(gè)最近新建立的多糖裂解酶家族,該家族褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制還不清楚。石莼多糖作為石莼屬綠藻細(xì)胞壁中的主要成分,占藻類生物質(zhì)干重的8-29%。石莼多糖的組成單位有3-硫酸鼠李糖,艾杜糖醛酸,葡萄糖醛酸和木糖。石莼多糖裂解酶可以通過β-消除斷開3-硫酸鼠李糖與葡萄糖醛酸之間或3-硫酸鼠李糖與艾杜糖醛酸之間的糖苷鍵。現(xiàn)階段,鑒定的石莼多糖裂解酶分布于PL24、PL25、PL28和PL37家族。目前僅有少數(shù)石莼多糖裂解酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制得到闡明。在CAZY數(shù)據(jù)庫中,Aly36B是一個(gè)來自細(xì)菌Chitinophaga sp.MD3的預(yù)測的PL36家族褐藻膠裂解酶,Uly1是一個(gè)來自細(xì)菌Catenovulum maritimum的預(yù)測的PL24家族石莼多糖裂解酶。本論文對(duì)PL36家族褐藻膠裂解酶Aly36B和PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究,解析了 Aly36B和Uly1的結(jié)構(gòu),并根據(jù)結(jié)構(gòu)和突變分析揭示了 Aly36B催化降解褐藻膠的分子機(jī)制和Uly1催化降解石莼多糖的分子機(jī)制。(1)PL36家族褐藻酸裂解酶Aly36B的異源表達(dá)與性質(zhì)研究序列分析表明Aly36B屬于PL36家族,與反硝化黃桿菌中的褐藻膠裂解酶H600DRAFT_04136的序列相似度最高,相似度為49%。將去掉信號(hào)肽的Aly36B在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)、純化和性質(zhì)分析。Aly36B的最適溫度為35℃,最適pH為9.0。Aly36B對(duì)NaCl的耐受比較低,在不添加NaCl的情況下酶活最高。Aly36B對(duì)聚甘露糖醛酸(PM)活性最高,對(duì)聚古洛糖醛酸(PG)的降解能力很低,表明Aly36B是一個(gè)PM特異性的裂解酶。Aly36B以褐藻膠為底物的Km是0.46±0.08 mg/mL,以PM為底物的Km是0.30±0.10 mg/mL。產(chǎn)物分析結(jié)果顯示,Aly36B對(duì)PM的降解產(chǎn)物主要為二糖,還有少量單糖及大于二糖的寡糖,所以Aly36B是一個(gè)內(nèi)切酶。凝膠過濾層析結(jié)果顯示,Aly36B在溶液中以單體的形式存在。(2)PL36家族褐藻膠裂解酶AIy36B的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制研究我們通過結(jié)晶解析了 PL36家族褐藻膠裂解酶Aly36B的結(jié)構(gòu),Aly36B采用β折疊(β-sandwich fold)的折疊方式,與PL7、PL14和PL18家族的褐藻膠裂解酶的折疊方式類似。Aly36B的結(jié)構(gòu)由兩個(gè)反向平行的β片層、一個(gè)α螺旋和四個(gè)loop構(gòu)成。在Aly36B遠(yuǎn)離催化腔的位置有一個(gè)鈣離子,我們檢測了鈣離子的功能,發(fā)現(xiàn)鰲合掉鈣離子之后并沒有影響蛋白的酶活,但是卻降低了酶的穩(wěn)定性,說明Aly36B中的鈣離子有穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的功能。這是首次揭示PL36家族褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)。為了研究Aly36B降解褐藻膠的催化機(jī)制,我們構(gòu)建了 Aly36B失活突變體K143A、K143A/M171A 和 K143A/Y185A,并得到了 K143A/M171A-M3 和K143A/Y185A-M4兩套復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。Aly36B降解褐藻膠四糖的主要產(chǎn)物為二糖,說明Aly36B斷裂四糖的位點(diǎn)在+1位與-1位之間。從結(jié)構(gòu)中看出Lys143與+1位C5的距離為2.65 A,與04的距離為2.88 A,Lys143在PL36家族高度保守,且當(dāng)Lys143突變成丙氨酸時(shí),酶活基本喪失,所以我們推測Lys143可以同時(shí)做催化酸堿。Arg169、Tyr185和Tyr187三個(gè)氨基酸殘基在+1位C5周圍,在PL36家族也是高度保守,當(dāng)把它們突變成丙氨酸后,酶活也基本喪失,這說明Arg169、Tyr185和Tyr187可能負(fù)責(zé)穩(wěn)定+1位的C5。氨基酸殘基Arg140和Tyr173與底物+2位的羧基有相互作用,當(dāng)把這兩個(gè)氨基酸殘基突變成丙氨酸時(shí),突變體的K-值增大,表明突變使酶與底物的親和力降低。因此Arg140和Tyr173與底物+2位羧基的識(shí)別有關(guān)。結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析和關(guān)鍵位點(diǎn)的突變分析,我們提出了 Aly36B的催化機(jī)制。首先,C5羧酸鹽基團(tuán)上的負(fù)電荷被Arg169、Tyr185和Tyr187中和,從而可以更容易地除去C5質(zhì)子。接下來,Lys143從甘露糖醛酸的C5吸引質(zhì)子,形成羧酸鹽二價(jià)陰離子中間體。最后,Lys143向糖苷鍵的氧提供質(zhì)子,在C4和C5之間形成雙鍵,產(chǎn)生的寡糖被釋放,Aly36B準(zhǔn)備去催化下一個(gè)底物。這是首次闡明PL36家族褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制。通過與其它褐藻酸裂解酶的催化機(jī)制的比對(duì)分析表明,Aly36B的催化機(jī)制與之前提出的褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制都不同,是一種新的褐藻膠裂解酶催化機(jī)制。(3)PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的異源表達(dá)與性質(zhì)研究石莼多糖裂解酶Uly1能夠降解石莼多糖,最適溫度為40℃,最適pH為9.0。我們研究了 Uly1的熱穩(wěn)定性,在40℃保溫一小時(shí)Uly1就喪失一半的酶活,這說明Uly1的熱穩(wěn)定性較差。在500 mM的NaCl濃度下Uly1酶活最高,是不加NaCl時(shí)酶活的1.5倍,所以Uly1是一個(gè)鹽激活的蛋白。金屬離子Mg2+,Li+,K+和Ca2+對(duì)酶活的影響較小,1 mM的Co2+和Mn2+顯著降低酶活。為了研究Uly1對(duì)石莼多糖的降解模式,Uly1的酶切產(chǎn)物用凝膠過濾層析檢測分析,發(fā)現(xiàn)Uly1的酶解產(chǎn)物超過一種寡糖,表明Uly1以內(nèi)切的方式降解多糖。收集主產(chǎn)物,用負(fù)電噴霧電離質(zhì)譜法檢測產(chǎn)物的分子量,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)分子量為401.03的產(chǎn)物峰與石莼二糖的分子量相吻合,表明Uly1酶解石莼多糖的主要產(chǎn)物為二糖。(4)PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的結(jié)構(gòu)解析和催化機(jī)制研究凝膠過濾層析的結(jié)果顯示Uly1在溶液中是以單體的形式存在。我們對(duì)Uly1進(jìn)行了結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果表明,Uly1采用七葉β-螺旋槳(β-propeller)結(jié)構(gòu),每個(gè)槳片都由四個(gè)反向平行的折疊片構(gòu)成。Uly1的電子密度顯示Uly1包括兩個(gè)金屬離子。ICP-OES結(jié)果顯示這兩個(gè)金屬離子為鈣離子,可能來自結(jié)晶的池液。Uly1的結(jié)構(gòu)是第二個(gè)解析的PL24家族石莼多糖裂解酶結(jié)構(gòu)。將Uly1與同源蛋白底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)疊加后發(fā)現(xiàn)His128、His149、Tyr223和Arg239四個(gè)氨基酸殘基在催化位點(diǎn)附近,且在PL24家族高度保守,所以可能參與催化反應(yīng)。結(jié)構(gòu)分析表明,His149、Tyr223和Arg239與+1位葡萄糖醛酸的C5有相互作用,當(dāng)把氨基酸殘基His149、Tyr223和Arg239突變成丙氨酸時(shí),突變體僅殘留50%的酶活,表明His149、Tyr223和Arg239負(fù)責(zé)穩(wěn)定C5的羧基。His128距離04和C5的距離最近,當(dāng)把His128突變成丙氨酸,酶活基本完全喪失,所以His128可能同時(shí)做催化酸和催化堿。Uly1的催化機(jī)制與已闡明的PL24家族石莼多糖裂解酶LOR_107的催化機(jī)制相似。本論文首次解析了 PL36家族褐藻酸裂解酶A1y36B的晶體結(jié)構(gòu),并揭示了該酶與其他家族褐藻膠裂解酶催化機(jī)制不同的新催化機(jī)制。本論文還闡明了PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。研究結(jié)果豐富了我們對(duì)海藻多糖裂解酶的認(rèn)識(shí),也為海藻多糖裂解酶的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：Q946.5
【部分圖文】：

?山東人蘋防士＃位論文???Ａ?ＣＯＯ??Ｒ?〇Ｈ?／Ｉ——〇，?ＯＨ??ｈｏＫＳｈＪ＾??３?－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ?（Ｍ）?〇?－［－－ｇｕｌｕｒｏｎａｔｅ?（Ｇ）??Ｕ巍喊。Ｉ??ＯＨ?Ｑ〇〇Ｃ?Ｗ〇、??Ｇ?Ｇ?Ｍ?Ｍ?Ｇ??Ｃ?ＭＭＭＭＧＭＧＧＧＧＧＭＧＭＧＧＧＧＧＧＧＧＭＭＧＭＧＭＧＧＭ??［?｜?ｔ?｜?｜?Ｉ?１?｝??ＰＭ?ＰＧ?ＰＧ?Ｐ（ＭＧ）??圖１－１．褐藻酸的結(jié)構(gòu)特征（Ｓｉｌｖａ?ａｎｄ?ｋｕｍａｒ?１９８４）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?ａｌｇｉｎａｔｅ．?Ａ，?Ｍｏｎｏｍｅｒ?ｏｆ?Ｐ－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ?（Ｍ）??ｏｒ?ａ－Ｌ－ｇｕｌｕｒｏｎａｔｅ?（Ｇ）．?Ｂ，?Ａｌｇｉｎａｔｅ?ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．?Ｃ，?Ｂｌｏｃｋｓ?ｏｆ?ＰＭ，?ＰＧ?ａｎｄ?Ｐ（ＭＧ）．??現(xiàn)階段，用于商業(yè)應(yīng)用的褐藻酸都來源于海藻植物，褐藻膠具有良好的理化??性質(zhì)，比如毒性低、成凝膠能力強(qiáng)、可生物降解以及生物相容性好，所以能很好??的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工等各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)藥領(lǐng)域，褐藻酸可以用于藥物和蛋??白質(zhì)的輸送，穩(wěn)定藥物和延長藥物釋放（Ｐａｗａｒ?ａｎｄ?Ｅｄｇａｒ?２０１２）。褐藻酸具有良??好的親水特性，可用作外科手術(shù)的敷料，褐藻酸敷料可以控制治療藥物（如止痛、??抗菌和抗炎藥）的釋放，加速傷口愈合。具有良好的生物相容性的褐藻酸還可以??制成止血海綿、噴霧止血?jiǎng)┑�，或者作為支架材料，用作關(guān)節(jié)軟骨部分損傷和完??全損傷的治療（Ｃｈｉｕ?ｅｔａｌ．?２００８）。另外，褐藻酸鹽還具有增強(qiáng)機(jī)體免

構(gòu)，ＰＬ５家族目前有兩個(gè)蛋白結(jié)??構(gòu)被解析，分別是Ａｌ－ＩＩＩ?（ＰＤＢ號(hào)：１ＱＡＺ）和ＡｌｇＬ?（ＰＤＢ號(hào)：４０ＺＷ）（圖??１－２）。Ａ１－ＩＩＩ的三維結(jié)構(gòu)具有豐富的螺旋結(jié)構(gòu)，在（ａ６／ｃｔ５）滾筒結(jié)構(gòu)中有一個(gè)??深隧道狀裂縫，在糖化酶和纖維素酶中也發(fā)現(xiàn)這種類似的（（ｘ６／ａ５）筒體結(jié)構(gòu)（Ｙｏｏｎ??ｅｔ?ａｌ．?２００１，?Ｍｉｋａｍｉ?ｅｔ?ａｌ．?２０１２）。在這種滾筒結(jié)構(gòu)中，海藻酸分子穿過裂縫與Ａ１－ＩＩＩ??的催化位點(diǎn)結(jié)合，ＡｌｇＬ的結(jié)構(gòu)與Ａ１－ＩＩＩ相似。??參參??圖１－２．?ＰＬ５家族解析的褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２．?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ＰＬ５?ａｌｇｉｎａｔｅ?ｌｙａｓｅｓ．?Ａ，?Ａｌ－ＩＩＩ?（ＰＤＢ：?１ＱＡＺ）?ｆｒｏｍ??Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ?ｓｐ．?Ａｌ．?Ｂ，?ＡｌｇＬ?（ＰＤＢ：?４０ＺＷ）?ｆｒｏｍ?Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ?ＰＡＯｌ．??ＰＬ６家族的褐藻膠裂解酶采用ｐ－螺旋的折疊方式，現(xiàn)階段，有三個(gè)ＰＬ６家族??酶的結(jié)構(gòu)被解析，分別是?ＢｃｅｌＰＬ６?（ＰＤＢ?號(hào)：６ＱＰＳ）?（Ｓｔｅｎｄｅｒｅｔａｌ．?２０１９）、ＡｌｙＧＣ??（ＰＤＢ?號(hào)：５ＧＫＤ）?（Ｘｕｅｔａｌ．?２０１７）和?ＡｌｙＦ?（ＰＤＢ?號(hào)：６ＩＴＧ）?（Ｌｙｕｅｔａｌ．?２０１９）。??ＡｌｙＧＣ是ＰＬ６家族第一個(gè)解析結(jié)構(gòu)的酶，它在溶液中以二體的形式存在，且以??二體的形式發(fā)揮功能，每個(gè)單體由碳端和氮端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都是??采用右手平行Ｐ螺旋的折疊形式，兩個(gè)碳端結(jié)構(gòu)域近乎平行，而兩個(gè)氮端結(jié)構(gòu)域??指向相反的方向。ＡｌｙＧＣ中有個(gè)Ｃａ２＋位

山東大學(xué)博士學(xué)位論文??ＩＩＷ??圖１－３．?ＰＬ６家族解析的褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ＰＬ６?ａｌｇｉｎａｔｅ?ｌｙａｓｅｓ．?Ａ，?ＡｌｙＦ?（６ＩＴＧ）?ｆｒｏｍ?Ｖｉｂｒｉｏ??ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ．?Ｂ，?ＢｃｅｌＰＬ６?（６ＱＰＳ）?ｆｒｏｍ?Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ?ＤＳＭ?１４８３８．?Ｃ，??ＡｌｙＧＣ?（５ＧＫＤ）?ｆｒｏｍ?Ｐａｒａｇｌａｃｉｅｃｏｌａ?ｃｈａｔｈａｍｅｎｓｉｓ?Ｓ１８Ｋ６Ｔ．??ＰＬ７家族是解析結(jié)構(gòu)最多的褐藻膠裂解酶酶家族，己經(jīng)有十個(gè)褐藻膠裂解酶??的結(jié)構(gòu)被解析，包括?ａｌｙＰＧ?（ＰＤＢ?號(hào)：１ＵＡＩ）?（Ｏｓａｗａｅｔａｌ．?２００５）、ＡｌｇＡＴ５?（ＰＤＢ??號(hào)：５ＺＱＩ）、ＦｌＡｌｙＡ?（ＰＤＢ?號(hào)：５Ｙ３３）?（Ｑｉｎｅｔａｌ．?２０１８）、ＡｌｙＡ?（ＰＤＢ?號(hào)：４０ＺＸ）、??ＡｌｙＱ?（ＰＤＢ?號(hào)：５ＸＮＲ）?（Ｓｉｍ?ｅｔ?ａｌ．?２０１７）、ＰＡ１１６７?（ＰＤＢ?號(hào)：１ＶＡＶ）、Ａ１－ＩＩ＇??（ＰＤＢ?號(hào)：２ＣＷＳ）、ＡｌｙＢ?（ＰＤＢ?號(hào)：５ＺＵ５）?（Ｌｙｕ?ｅｔ?ａｌ．?２０１８）?．?ＡｌｙＡ５?（ＰＤＢ??號(hào)：４ＢＥ３）和?ＡｌｙＡｌ?（ＰＤＢ?號(hào)：３ＺＰＹ）。Ｓ／＾／／７ｇｏｗｏｍ？．ｓｐ＿Ａｌ?的?Ａｌ－ＩＩ’整體結(jié)??構(gòu)是Ｐ－卷曲結(jié)構(gòu)（Ｐ－ｊｅｌｌｙｒｏｌｌ，Ｐ－ｓａｎｄｗｉｃｈ），是由兩個(gè)反向平行的（３－折疊片層和??四個(gè)小的ａ－螺旋組成，每個(gè)（３－折疊片層包含多個(gè)Ｐ－片（Ｏｇｕｒａｅｔａｌ．２００８）（圖１－４）。??其它ＰＬ７家族的褐藻膠裂解酶的整
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