發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 16:30

【摘要】：蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和分離純化是生產(chǎn)基因重組藥物和高附加值基因產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。本文針對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程的兩個(gè)關(guān)鍵因素(促進(jìn)二硫鍵形成和抑制蛋白質(zhì)聚集),開(kāi)展蛋白質(zhì)復(fù)性助劑的研究和蛋白質(zhì)復(fù)性與集成純化方法的研發(fā)。針對(duì)二硫鍵形成問(wèn)題,從模擬蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的疏水區(qū)域和正電區(qū)域出發(fā),設(shè)計(jì)得到模擬寡肽RKCGCFF。研究表明,與傳統(tǒng)氧化劑GSSG和短肽RKCGC相比,RKCGCFF能夠更好地提高變性還原溶菌酶氧化復(fù)性的速率和收率,且對(duì)較高濃度的溶菌酶也具有較好的輔助復(fù)性的效果。分析認(rèn)為,由于RKCGCFF分子中同時(shí)引入了疏水區(qū)域和正電區(qū)域,使其在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上都更加接近于PDI,因此使其在促進(jìn)二硫鍵形成的同時(shí),又具有一定的抑制蛋白質(zhì)聚集的效果,亦即類(lèi)似于PDI的分子伴侶功能。針對(duì)蛋白質(zhì)聚集問(wèn)題,基于前人研究發(fā)現(xiàn)的同電荷微球能夠有效抑制蛋白質(zhì)聚集,且其效果與介質(zhì)的電荷密度正相關(guān)的結(jié)論,本研究在二氧化硅納米粒子(SNPs)表面接枝聚乙烯亞胺分子(PEI)并二次修飾2-二乙氨基氯乙基(DEAE),得到一系列高電荷密度以及高比表面積的陽(yáng)離子納米顆粒。利用它們輔助帶正電荷的溶菌酶的氧化復(fù)性的研究表明,高電荷密度的納米粒子能夠在極低的介質(zhì)添加量時(shí)高效輔助同電荷溶菌酶的復(fù)性。與PGMA微米球相比,介質(zhì)用量下降了96%。由此證實(shí),具有高電荷密度和比表面積的納米介質(zhì)更適合應(yīng)用于同電荷介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法中。在上述研究的基礎(chǔ)上,針對(duì)重組蛋白在復(fù)性中的純化問(wèn)題,本研究在瓊脂糖凝膠介質(zhì)(Sepharose FF)表面修飾亞氨基二乙酸(IDA),制備得到一種金屬螯合介質(zhì)IDA-Sepharose FF。利用IDA的負(fù)電性質(zhì)和金屬螯合性質(zhì),建立了一種同電荷輔助復(fù)性與集成純化的方法,用于輔助六聚組氨酸標(biāo)記的重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(6×his-EGFP)包含體的復(fù)性與純化。研究表明,IDA-Sepharose FF介質(zhì)能夠快速高效地輔助6×his-EGFP包含體的復(fù)性,并且在輔助復(fù)性的同時(shí),能夠吸附部分雜蛋白,具有初步純化的效果。特別是在復(fù)性之后,通過(guò)引入少量鎳離子即可實(shí)現(xiàn)對(duì)6×his-EGFP的特異性吸附,最終得到高收率(85%)以及高純度(93%)的目標(biāo)蛋白。進(jìn)一步采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)接枝方法,制備得到高IDA接枝量的納米粒子,并且發(fā)現(xiàn)具有高電荷密度的金屬螯合納米粒子能夠進(jìn)一步提高6×his-EGFP包含體的復(fù)性與純化效果,體現(xiàn)出其在實(shí)際應(yīng)用中的更大優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q51
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性
        1.1.1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性
        1.1.2 蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理
        1.1.3 影響蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的關(guān)鍵因素
    1.2 促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵形成的方法
        1.2.1 體內(nèi)促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵形成的氧化還原酶
        1.2.2 體外促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵形成的小分子氧化還原劑
    1.3 抑制蛋白質(zhì)聚集的方法
        1.3.1 體內(nèi)抑制蛋白質(zhì)聚集的分子伴侶
        1.3.2 體外抑制蛋白質(zhì)聚集的小分子抑制劑
        1.3.3 色譜復(fù)性
        1.3.4 其他抑制聚集的復(fù)性方法
    1.4 蛋白質(zhì)的親和純化技術(shù)
        1.4.1 親和純化的原理
        1.4.2 親和純化的種類(lèi)
        1.4.3 金屬螯合親和純化
    1.5 本研究的內(nèi)容及意義
第二章 二硫鍵異構(gòu)酶模擬寡肽的設(shè)計(jì)及其促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化復(fù)性
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 蛋白質(zhì)的還原變性
        2.2.3 蛋白質(zhì)的氧化復(fù)性動(dòng)力學(xué)
        2.2.4 蛋白質(zhì)的酶活測(cè)定
        2.2.5 二硫鍵氧化還原勢(shì)的測(cè)定
        2.2.6 巰醇pKa值的測(cè)定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.3.1 二硫鍵異構(gòu)酶模擬寡肽的設(shè)計(jì)
        2.3.2 不同氧化劑的比較
        2.3.3 較高濃度溶菌酶的復(fù)性
    2.4 小結(jié)
第三章 高電荷密度的納米粒子在蛋白質(zhì)吸附和同電荷蛋白質(zhì)復(fù)性中的應(yīng)用
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 二氧化硅納米粒子表面的電荷修飾
        3.2.3 電荷修飾的納米粒子的表征
        3.2.4 溶菌酶的變性和復(fù)性
        3.2.5 溶菌酶的酶活測(cè)定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.3.1 電荷修飾的納米粒子的性質(zhì)表征
        3.3.2 電荷修飾的納米粒子對(duì)BSA的吸附
        3.3.3 電荷修飾的納米粒子輔助溶菌酶復(fù)性
        3.3.4 電荷修飾的納米粒子與微米球輔助溶菌酶復(fù)性效果的比較
    3.4 小結(jié)
第四章 同電荷金屬螯合介質(zhì)輔助 6×his-EGFP包含體的復(fù)性與集成純化過(guò)程
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 亞氨基二乙酸修飾的Sepharose FF介質(zhì)的制備
        4.2.3 IDA-Sepharose FF介質(zhì)的性質(zhì)表征
        4.2.4 重組綠色熒光蛋白包含體的制備
        4.2.5 包含體中目標(biāo)蛋白 6×his-EGFP純度的測(cè)定
        4.2.6 總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
        4.2.7 天然 6×his-EGFP的純化
        4.2.8 活性 6×his-EGFP的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定
        4.2.9 6×his-EGFP的變性和復(fù)性
        4.2.10 IDA-Sepharose FF介質(zhì)的臨界金屬離子濃度測(cè)定
        4.2.11 復(fù)性后 6×his-EGFP的金屬螯合親和吸附
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 介質(zhì)的性質(zhì)表征
        4.3.2 純化 6×his-EGFP的復(fù)性
        4.3.3 6×his-EGFP的金屬螯合親和吸附
        4.3.4 6×his-EGFP包含體的復(fù)性與集成純化
    4.4 小結(jié)
第五章 高電荷密度的金屬螯合納米介質(zhì)強(qiáng)化 6×his-EGFP包含體的復(fù)性與集成純化
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 ATRP方法制備接枝型納米粒子SNPs-PGI
        5.2.3 納米介質(zhì)SNPs-PGI的性質(zhì)表征
        5.2.4 天然 6×his-EGFP的純化和包含體的制備
        5.2.5 6×his-EGFP包含體的變性和復(fù)性
        5.2.6 鎳離子對(duì)復(fù)性后 6×his-EGFP包含體的分離純化
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        5.3.1 SNPs-PGI的制備和性質(zhì)表征
        5.3.2 SNPs-PGI的電荷性質(zhì)和 6×his-EGFP吸附容量
        5.3.3 SNPs-PGI輔助 6×his-EGFP包含體復(fù)性
        5.3.4 SNPs-PGI對(duì)復(fù)性后 6×his-EGFP包含體的純化
    5.4 小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明
致謝

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本文編號(hào)：2887703