AHBA陽性菌的分離篩選及其中兩株菌的產(chǎn)物挖掘與生物合成研究
發(fā)布時間：2020-12-06 16:23
抗生素耐藥性問題是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域當前面臨的主要威脅之一,研發(fā)與已知抗生素缺少交叉耐藥性的新型藥物是持續(xù)的社會需求。放線菌作為主要的小分子藥物來源一直備受到天然產(chǎn)物化學(xué)家的青睞,幾十年來,盡管放線菌的分離方法并未發(fā)生根本性的變革,但放線菌天然產(chǎn)物的研究已經(jīng)由傳統(tǒng)的活性指導(dǎo)為主的發(fā)現(xiàn)方式逐漸變革為基因（簇/組）序列指導(dǎo)為主的發(fā)現(xiàn)方式,序列指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物使得其生物合成研究的開展變得順理成章,生物合成研究獲得的新知識反過來又可以促進天然產(chǎn)物的理性發(fā)現(xiàn),形成良性循環(huán),有望引起天然產(chǎn)物研究的再次復(fù)興。本論文從土壤放線菌選擇性分離與優(yōu)選、兩株高新穎性菌株的基因組挖掘和挖掘產(chǎn)物的生物合成三方面開展了系統(tǒng)的研究。通過放線菌的選擇性分離和去重復(fù),我們從來自全國各地的55份土壤樣品中分離獲得了 779株放線菌,其中稀有放線菌276株,占比35.4%。通過PCR篩選兼具保守性和特異性的AHBA合酶基因,我們共獲得了 54株AHBA合酶基因陽性菌（S001-S054）,部分菌株由于保存后未能成功復(fù)蘇,實際獲得AHBA 陽性菌44株。我們從中挑選了 AHBA合酶基因新穎性最高的兩株鏈霉菌S001和S006進...
【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：159 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．６通過調(diào)控基因操縱獲得的天然產(chǎn)物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｏｐｅｒａｔｉｎｇ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｇｅｎｅｓ??ｌｌ??
東大學(xué)博士學(xué)位論文???從汾ｒｅ／＾ｍｙａｓｐ．?ＰＧＡ６４中成功激活并分離了兩個蒽醌氨基糖苷類化合物??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ?和?Ｅ?（圖?１．７）。??Ｖｊ；〇??°Ｓ￥〇：〇ｊ６?ｒ％０??—?一Ａ?ｉｎｄｕｃａ副ｅｃ??ｐｉｐｅｒｉｄａｍｙｃｉｎ?Ｆ：?Ｒ，＝?ＣＨ３，?Ｒ２＝?ＣＨ３??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｅ?Ｊ，Ｈ??＾?ＩＮｎ２?ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ??ｍｄｕｃａｍｉｄｅ?Ａ：?Ｒ?＝?Ｃｌ??ｉｎｄｕｃａｍｉｄｅ?Ｂ：?Ｒ?＝?Ｈ??圖１．７通過突變選擇獲得的天然產(chǎn)物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．７?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｍｕｔａｎｔｓ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??１．１．５轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略??動輒幾十甚至上百ｋｂ大小的ＰＫＳ／ＮＲＰＳ基因簇，其中可能包含多個操縱子，??涉及到的轉(zhuǎn)錄調(diào)控比較復(fù)雜，因此有時操縱途徑特異性調(diào)控因子或單個強啟動子??置換的策略未必能夠有效激活沉默基因簇。Ｗａｎｇ等人最近開發(fā)了一種可以在轉(zhuǎn)??錄調(diào)控層面定向激活沉默基因簇的策略，命名為轉(zhuǎn)錄因子誘館（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ??ｆａｃｔｏｒ?ｄｅｃｏｙ，?ＴＦＤ）策略。ＴＦＤ是一段模擬了調(diào)控因子結(jié)合ＤＮＡ的序列，在ＴＦＤ??大量存在的情況下，可以競爭性地結(jié)合調(diào)控因子，使基因簇中調(diào)控因子的靶序列??得以釋放，從而激活或抑制（根據(jù)調(diào)控因子正負而分）目標基因簇的表達。為了高??通量地激活目標微生物中的多個沉默基因簇，可以將ＴＦＤ克隆至高拷貝質(zhì)粒上??的無啟動子的卡那霉素抗性基因上游，通過抗性篩選，確定最終用于發(fā)酵檢測的??突變株。通過ＴＦＤ策略，Ｗａｎｇ等人成功激活了多個鏈
品。到目前為止，絕大多數(shù)的ＦＤＨ屬于雙組份的鹵代酶，即需要ＦＲ作??為輔酶，催化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ還原Ｆｌａｖｉｎ。只有三個特殊的ＦＤＨ不需要ＦＲ的參與，??作為單組份的ＦＤＨ完成鹵代反應(yīng)。來源于海洋的假交替單胞菌屬的Ｂｍｐ５，可??以催化４－羥基苯甲酸生成３－溴－４－羥基苯甲酸，以及催化３－溴－４－羥基苯甲酸的脫??羧溴代反應(yīng)，生成２，４－二溴苯酚８７，其他兩個為該基因的同源基因８８。??？卞，Ｔ??－）〇５ｃ？°??Ｒ?ｒ￥?“ｅｇ?Ｌｙｓｖ?／?趣??ｖｖ－＂Ｌｙ？??圖１．１０?ＦＤＨ的催化機制．（Ａ）?ＦＤＨ催化鹵代反應(yīng)過程中異咯嗪環(huán)中的氧化還原反應(yīng)；（Ｂ）??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２?（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）中黃素輔因子中異咯嗪環(huán)與ＦＤＨ鹵代活性賴氨酸的相對位置??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１０?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＦＤＨ．?（Ａ）?Ｒｅｄｏｘ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ｄｕｒｉｎｇ??ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ?ｃａｔａｌｙｚｅｄ?ｂｙ?ＦＤＨ；?（Ｂ）?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ｆｌａｖｉｎ?ｃｏｆａｃｔｏｒ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｉｄｅ?ｃｈａｉｎ．??１．２．２催化游離底物鹵代的黃素依賴的鹵代酶研究??到目前為止，對于游離底物的鹵代酶的研究主要來源于細菌的色氨酸氯代酶。??對于色氨酸的氯代反應(yīng)可以發(fā)生在色氨酸苯環(huán)的５，６，７位８９?（圖１．１１）。來自抗真??菌天然產(chǎn)物比洛尼群（ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）生物合成基因簇的色氨酸－７位氯代酶ＰｍＡ是??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]超聲波處理土樣分離放線菌[J]. 姜怡,曹艷茹,趙立興,王茜,靳榮線,和文祥,薛泉宏. 微生物學(xué)報. 2010(08)
本文編號：2901680
【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：159 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．６通過調(diào)控基因操縱獲得的天然產(chǎn)物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｏｐｅｒａｔｉｎｇ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｇｅｎｅｓ??ｌｌ??
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品。到目前為止，絕大多數(shù)的ＦＤＨ屬于雙組份的鹵代酶，即需要ＦＲ作??為輔酶，催化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ還原Ｆｌａｖｉｎ。只有三個特殊的ＦＤＨ不需要ＦＲ的參與，??作為單組份的ＦＤＨ完成鹵代反應(yīng)。來源于海洋的假交替單胞菌屬的Ｂｍｐ５，可??以催化４－羥基苯甲酸生成３－溴－４－羥基苯甲酸，以及催化３－溴－４－羥基苯甲酸的脫??羧溴代反應(yīng)，生成２，４－二溴苯酚８７，其他兩個為該基因的同源基因８８。??？卞，Ｔ??－）〇５ｃ？°??Ｒ?ｒ￥?“ｅｇ?Ｌｙｓｖ?／?趣??ｖｖ－＂Ｌｙ？??圖１．１０?ＦＤＨ的催化機制．（Ａ）?ＦＤＨ催化鹵代反應(yīng)過程中異咯嗪環(huán)中的氧化還原反應(yīng)；（Ｂ）??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２?（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）中黃素輔因子中異咯嗪環(huán)與ＦＤＨ鹵代活性賴氨酸的相對位置??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１０?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＦＤＨ．?（Ａ）?Ｒｅｄｏｘ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ｄｕｒｉｎｇ??ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ?ｃａｔａｌｙｚｅｄ?ｂｙ?ＦＤＨ；?（Ｂ）?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ｆｌａｖｉｎ?ｃｏｆａｃｔｏｒ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｉｄｅ?ｃｈａｉｎ．??１．２．２催化游離底物鹵代的黃素依賴的鹵代酶研究??到目前為止，對于游離底物的鹵代酶的研究主要來源于細菌的色氨酸氯代酶。??對于色氨酸的氯代反應(yīng)可以發(fā)生在色氨酸苯環(huán)的５，６，７位８９?（圖１．１１）。來自抗真??菌天然產(chǎn)物比洛尼群（ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）生物合成基因簇的色氨酸－７位氯代酶ＰｍＡ是??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]超聲波處理土樣分離放線菌[J]. 姜怡,曹艷茹,趙立興,王茜,靳榮線,和文祥,薛泉宏. 微生物學(xué)報. 2010(08)
本文編號：2901680
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