發(fā)布時間：2018-01-18 11:26

  本文關鍵詞：腸出血性大腸桿菌耐酸相關新基因的篩選與鑒定　出處：《廣西醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 腸出血性大腸桿菌 酸耐受 轉(zhuǎn)錄組 基因敲除

【摘要】：EHEC O157:H7是致病性大腸桿菌最具代表性的一種血清型,是一種食源和水源性致病菌,歷史有數(shù)次食源性暴發(fā),感染來源通常是食用牛糞便污染的食物,感染量極低�？梢�起出血性結腸炎(HC)、溶血性尿毒癥(HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP),嚴重可致命。目前針對EHEC感染仍沒有良好的治療藥物,志賀毒素是其最重要的毒力決定簇,在引發(fā)HC和HUS中有非常重要的作用;其他的毒力因子如黏附素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應分子、溶血素等在EHEC的感染與定植中都有著十分重要的作用;EHEC的耐酸因子是另一種重要的毒力因子,在EHEC生存和侵襲中發(fā)揮了重要作用,維持EHEC在發(fā)酵食品和酸性食品中的生存,幫助細菌順利通過胃酸環(huán)境而進入腸道定植感染,還有研究表明酸處理后的EHEC增加了黏附上皮Hep-2和Ca Co2細胞系的能力和細胞凋亡。大腸桿菌有復雜的耐酸系統(tǒng),這使得大腸桿菌可以適應多種酸性環(huán)境壓力,可以在極端的p H環(huán)境中生存數(shù)小時。目前隨著對普通非致病性大腸桿菌耐酸機制研究的深入,發(fā)現(xiàn)了一系列新的耐酸相關的基因及調(diào)控子,逐步揭示大腸桿菌復雜的耐酸網(wǎng)絡。相比較普通大腸桿菌,EHEC有著更為復雜的耐酸系統(tǒng)和更好的耐酸能力,其基因組上特有的O島編碼了一系列環(huán)境適應能力相關的分子,需要進一步挖掘和鑒定。應用轉(zhuǎn)錄組學研究策略有助于發(fā)掘一些新的耐酸相關基因和調(diào)控子,拓展我們對細菌酸調(diào)控系統(tǒng)的認識。本文針對EHEC EDL933菌株,通過胃酸環(huán)境p H2.5分別處理菌株15min 30min 45min以未處理組為對照組,對動態(tài)時間點的菌株開展轉(zhuǎn)錄組學研究,運用生物信息學分析繪制細菌酸應答表達譜,系統(tǒng)研究了本研究中激活的耐酸相關的通路和分子,發(fā)現(xiàn)了膜蛋白在EHEC耐酸應答中的重要作用及磷酸戊糖途徑的下調(diào)等,并從中篩選出參與耐酸應答網(wǎng)絡的17個潛在新基因z0168 z0474 z0602 z2088 z2163 z2211 z2272 z2328 z2716 z3132 z3919 z3963 z3971 z4286 z5466 z5751 z1075。進一步從實驗驗證的角度,應用Red重組技術在EHEC EDL933菌株中分別單敲除z0168 z0474 z0602等潛在耐酸新基因,成功構建13個缺失突變株(不包括z2088 z2716 z3132 z4286),進一步通過體外模擬胃酸p H2.5的實驗體系,初步驗證了yad S yai W yba Q等基因在極端酸環(huán)境中對于維持EHEC EDL933生存有重要作用。一、耐酸調(diào)控網(wǎng)絡分析及潛在耐酸基因的篩選通過體外模擬胃酸環(huán)境(p H2.5)處理EHEC EDL933菌株,首先對處理后菌株的基因表達進行轉(zhuǎn)錄組學研究,得到了以下的結果:1、篩選出不同處理時間點(15min 30min 45min)共有的差異表達基因262個,其中104個基因上調(diào),已注釋基因主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控子、結構蛋白、離子運輸?shù)鞍住⒚傅榷嗯c壓力相關;在158個下調(diào)的基因中,主要有代謝相關蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控子;2、KEGG富集分析顯示已知的功能基因主要富集在代謝相關通路中,如碳水化合物代謝和次級代謝產(chǎn)物合成等,其中碳代謝中下調(diào)的4個關鍵基因均參與磷酸戊糖途徑;3、耐酸系統(tǒng)中AR3通路明顯被激活,涉及兩個最重要的調(diào)控基因adi A、adi Y和最終的反轉(zhuǎn)運體Adi C;4、檢測到被激活的已報道耐酸相關的重要基因:adi Y mnt H fpr fnr cue O csp D csp H omp R等;5、細胞壁脂多糖合成、膜及相關蛋白的多個基因高表達;6、檢測到與已報道相一致的酸應答相關的氧化損傷、厭氧呼吸、冷激、饑餓、滲透壓、錳離子吸收、PTS系統(tǒng)部分基因被激活。7、結合文獻、Blast軟件結果及蛋白互作網(wǎng)絡、q PCR驗證,最終篩選出17個可能參與酸應答的潛在新基因(z0168 z0474 z0602等),用于實驗表型驗證,利用17個基因所在的家族和可能的功能注釋進一步將其定位在可能參與的酸應答通路中。二、酸應答潛在新基因?qū)�EHEC環(huán)境適應能力的影響針對已經(jīng)篩選出的17個目的基因,我們用Red重組技術進行敲除,成功構建13株相應的缺失突變株。首先檢測了不同缺失株的生長曲線,結果顯示:缺失突變株除了Δz5751生長較野生株稍慢,其余與野生株生長曲線并沒有明顯差異,說明敲除的目的基因并不影響EHEC EDL933菌株的生長。進一步我們對不同缺失株的抗逆環(huán)境能力進行檢測,如強酸環(huán)境(p H2.5的酸性培養(yǎng)基,培養(yǎng)2h)、在高鹽環(huán)境(6%Na Cl,16h)及高溫(65℃,10min)LB培養(yǎng)基下的存活情況,以野生株為對照。結果顯示:所有的缺失株的酸耐受能力均有十分顯著的下降(下降在幾十倍至數(shù)百倍之間),高鹽環(huán)境下只有部分缺失株表現(xiàn)出生存率較野生株稍低(下降在1~3倍之間),而高溫環(huán)境下缺失株與野生株生存率沒有明顯的統(tǒng)計學差異,說明所敲除的這些目的基因與EHEC的極端酸環(huán)境中生存密切相關,而對高鹽、高溫逆環(huán)境下EHEC的生存并沒有大的影響,初步說明了基因yad S yai W yba Q z2088 yde H yde M ydc Z ydb H ydi K mtf A ECs3486 csi R yga C yqg D yii R yje K ybj M可能直接或間接參與到EHEC菌株對極端酸環(huán)境的應答,為進一步的深入研究這些基因的功能及作用機制奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378.21
，

本文編號：1440740