發(fā)布時間：2018-01-19 18:47

  本文關(guān)鍵詞： 顳下頜關(guān)節(jié) 髁突軟骨 髁突肥大 細(xì)胞凋亡 Sonic hedgehog　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：髁突肥大(Condylar hyperplasia,CH)是發(fā)生于青少年的一種具有自限性的單側(cè)髁突過度生長性疾病,無性別差異,常導(dǎo)致患者面部偏斜和咬合紊亂,從而影響美觀和咀嚼。髁突肥大的確切發(fā)病機(jī)制未明,關(guān)于其治療方式目前仍以髁突高位切除術(shù)為主。因此,針對髁突肥大病因開展基礎(chǔ)研究,有助于探索新的治療方式,從而在疾病的早期阻斷其發(fā)生,減輕或避免手術(shù)帶來的創(chuàng)傷。大量臨床證據(jù)和組織學(xué)證據(jù)已證實患側(cè)髁突的生長活躍是髁突肥大的主要病因。髁突軟骨是髁突的生長中心,其生長過程包括軟骨細(xì)胞的增殖、分化、肥大及凋亡等重要過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),與正常髁突軟骨細(xì)胞相比,髁突肥大軟骨細(xì)胞的增殖能力顯著升高。但是關(guān)于髁突肥大軟骨細(xì)胞的凋亡活性變化對髁突肥大病理進(jìn)程的影響目前尚未見相關(guān)報道。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),在正常軟骨的生長發(fā)育過程中,Shh信號通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Shh信號通路的主要成分包括配體Shh,膜受體Ptc和Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli等。Tavella S等研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)的Shh信號通路能夠抑制小鼠肢體關(guān)節(jié)軟骨的凋亡。而且Shh信號能夠通過介導(dǎo)PI3K/AKT或ERK進(jìn)而來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。但是Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響尚未明晰,因此,本研究擬探究Shh信號通路在髁突肥大軟骨中的表達(dá)情況,并驗證Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響以及潛在的分子機(jī)制。實驗一、軟骨組織標(biāo)本的收集和軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)實驗方法:1,標(biāo)本來源:正常髁突軟骨標(biāo)本來至于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院髁突骨折手術(shù)患者(骨折塊無法固定),髁突肥大軟骨標(biāo)本源于武漢大學(xué)口腔醫(yī)院SPECT陽性的髁突肥大手術(shù)患者;2,組織標(biāo)本的處理:選取結(jié)構(gòu)完整的正常髁突軟骨標(biāo)本及髁突肥大軟骨標(biāo)本各3例,常規(guī)多聚甲醛固定,EDTA脫鈣;3,軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng):利用酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞;收集第二代軟骨細(xì)胞,轉(zhuǎn)藻酸鹽微珠三維培養(yǎng),以防止軟骨細(xì)胞的去分化。實驗結(jié)果:在平板培養(yǎng)狀態(tài)下,軟骨細(xì)胞形態(tài)多為多角形、三角形,少數(shù)呈圓形或短梭形,細(xì)胞集聚生長成簇,呈“鋪路石”樣外觀。藻酸鹽三維培養(yǎng)狀態(tài)下微珠呈水滴狀或圓形,軟骨細(xì)胞呈圓球形亮點狀散在分布。實驗結(jié)論:利用機(jī)械和酶聯(lián)合消化法能夠獲得細(xì)胞活性較高的髁突軟骨細(xì)胞。實驗二、Shh信號通路在髁突肥大軟骨細(xì)胞的表達(dá)變化情況實驗方法:1,選取正常髁突軟骨及髁突肥大軟骨組織標(biāo)本各3例,利用免疫組化染色檢測Shh及其膜受體Smo在兩組軟骨中的表達(dá)情況;2,在三維培養(yǎng)的第21天分別收集正常軟骨細(xì)胞及髁突肥大軟骨細(xì)胞,提取總蛋白及RNA,然后利用Western blotting及Real-time PCR分別從蛋白及基因水平檢測Shh及Smo在兩組軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果:免疫組化染色結(jié)果顯示,髁突肥大軟骨中Shh和Smo均呈異常高表達(dá),且主要集中于未分化間充質(zhì)層和肥大層。與正常髁突軟骨細(xì)胞相比,髁突肥大軟骨細(xì)胞中Shh和Smo蛋白和基因的表達(dá)水平均顯著增高(P0.05)。實驗結(jié)論:Shh信號通路在髁突肥大軟骨中呈異常高表達(dá)。實驗三、Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響實驗方法:將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為三組:正常髁突軟骨細(xì)胞組(NC組)、髁突肥大軟骨細(xì)胞組(CH組)及Cyclopamine(Smo受體阻斷劑)刺激肥大軟骨細(xì)胞組(CH+Cyclo組),在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別向CH+Cyclo組添加Cyclopamine刺激48h,分別提取總蛋白及RNA,然后利用Western blotting和Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果:與NC組相比,CH組中Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P0.05),添加Cyclopamine阻斷Shh信號通路之后,Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P0.05)。實驗結(jié)論:Shh信號通路能夠抑制髁突肥大軟骨細(xì)胞的凋亡。實驗四、Shh信號通路對軟骨細(xì)胞凋亡活性影響的機(jī)制研究實驗方法:將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為4組:CH組、CH+Cyclo組、LY294002刺激髁突肥大軟骨細(xì)胞組(CH+LY294002組)及U0126刺激髁突肥大軟骨細(xì)胞組(CH+U0126組)。在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別用Cyclopamine、LY294002(PI3K/AKT阻斷劑)及U0126(MAPK/ERK阻斷劑)刺激細(xì)胞48h,于第21天分別提取總蛋白和RNA,然后利用Western blotting檢測Cleaved-caspase3、AKT、ERK、P-AKT及P-ERK的表達(dá)變化情況,并用Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3 m RNA的表達(dá)情況。實驗結(jié)果:與CH組相比,CH+Cyclo組中AKT及ERK均無明顯變化(P0.05),但其磷酸化狀態(tài)P-AKT及P-ERK的表達(dá)卻顯著降低(P0.05)。與CH組相比,CH+LY294002刺激組和CH+U0126刺激組中Cleaved-caspase3基因與蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P0.05)。實驗結(jié)論:Shh能夠活化PI3K/AKT及MAPK/ERK這兩條通路,并通過介導(dǎo)PI3K/AKT和MAPK/ERK通路來抑制髁突肥大軟骨細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:In this study , it has been found that the growth of condylar cartilage is the main cause of condylar hypertrophy . The experimental results showed that the expression level of the gene and protein in condylar cartilage was significantly higher than that of normal condylar cartilage cells ( P0.05 ) . The experimental results showed that the expression of the gene and protein in condylar cartilage were significantly decreased by using the method of Western blotting and Real - time PCR . and the apoptosis of the condylar hypertrophy chondrocytes was inhibited by mediating the 3 - K / ERK and MAPK / ERK pathways .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R782

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本文編號：1445108