發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 22:17

　　 目的:納米氧化鋁由于其優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì),在光電子、催化劑、工程、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在生產(chǎn)過(guò)程中,納米氧化鋁可在產(chǎn)品制造、加工和廢物排放等過(guò)程中直接或間接釋放到環(huán)境中。當(dāng)生物體內(nèi)蓄積納米氧化鋁顆粒在達(dá)到一定閾值后可能會(huì)出現(xiàn)毒性效應(yīng)。然而,現(xiàn)有的毒理學(xué)證據(jù)很難確切地評(píng)估納米氧化鋁對(duì)水生生物和人體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此,本研究旨在探討納米氧化鋁對(duì)成年斑馬魚學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。方法:采用不同濃度(0、6.25、12.5、25.0、50.0、100 mg/L)的13 nm粒徑的氧化鋁處理受精后6 h的斑馬魚胚胎至受精后120 h結(jié)束,并在成年時(shí)(6、9和12月齡)檢測(cè)其神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo),評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力;本研究設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估斑馬魚胚胎期接觸納米氧化鋁是否會(huì)蓄積在大腦組織中并對(duì)其學(xué)習(xí)和記憶能力造成損害。我們用電子顯微鏡觀察了納米氧化鋁的表征,并用納米粒度儀測(cè)定了Zeta電位。采用焦慮活動(dòng)檢測(cè)試驗(yàn)、探索活動(dòng)檢測(cè)試驗(yàn)和T迷宮試驗(yàn),觀察了成年斑馬魚6、9和12月齡的神經(jīng)行為和學(xué)習(xí)記憶變化。此外,測(cè)定了腦組織中乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)等神經(jīng)遞質(zhì)生物標(biāo)志物,活性氧(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)等氧化應(yīng)激標(biāo)志物。另外,使用尼氏染色法檢測(cè)了腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目變化,通過(guò)電鏡觀察了腦組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)改變,RT-PCR檢測(cè)了自噬相關(guān)基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表達(dá),使用ICP-MS檢測(cè)了斑馬魚腦組織鋁的蓄積變化。結(jié)果:(1)腦鋁含量增加:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6和12月齡的斑馬魚腦組織中鋁含量增加,且存在劑量依賴效應(yīng),腦鋁含量隨劑量增加而升高。(2)焦慮樣行為加重:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6、9和12月齡的斑馬魚焦慮樣行為增加,包括平均速度和外區(qū)累積時(shí)間百分比顯著減少,凍結(jié)時(shí)間移動(dòng)率增加。且存在劑量和年齡依賴效應(yīng),隨劑量和年齡增加,焦慮樣行為逐漸加重。(3)新環(huán)境的探索行為減弱:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6、9和12月齡的斑馬魚對(duì)新環(huán)境的探索行為減弱,且存在劑量和年齡依賴效應(yīng),隨劑量和年齡增加,探索行為逐漸減弱。(4)記憶能力降低:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6和12月齡的斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力降低,且存在劑量和年齡依賴效應(yīng),包括潛伏期增加和累積停留時(shí)間減少。隨劑量和年齡增加,學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)進(jìn)行性損傷。(5)神經(jīng)遞質(zhì)含量降低:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6和12月齡的斑馬魚腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量降低,包括乙酰膽堿(ACh)和多巴胺(DA)的水平顯著下降。(6)氧化應(yīng)激反應(yīng)加重:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致6和12月齡的斑馬魚腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)加重,包括活性氧(ROS)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平顯著增加。(7)納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導(dǎo)致斑馬魚腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少且伴隨著自噬的發(fā)生,以及腦組織中自噬相關(guān)基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:納米氧化鋁在6.25 mg/L至100 mg/L的暴露濃度范圍內(nèi)對(duì)斑馬魚具有神經(jīng)毒性,我們發(fā)現(xiàn)低濃度(6.25 mg/L)的納米氧化鋁對(duì)6個(gè)月齡前的斑馬魚比較安全。隨著暴露劑量和持續(xù)時(shí)間的增加,包括低濃度(6.25 mg/L)在內(nèi)的所有劑量的納米氧化鋁都會(huì)引起斑馬魚學(xué)習(xí)和記憶的不良影響。斑馬魚胚胎期接觸納米氧化鋁對(duì)斑馬魚腦組織中的鋁含量具有劑量和年齡依賴性,并且隨著劑量和年齡的增加而顯著增加。暴露于納米氧化鋁會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)行為改變,學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性損傷。它還會(huì)導(dǎo)致斑馬魚腦組織中產(chǎn)生氧化應(yīng)激和多巴胺能傳遞受到破壞,腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少且伴隨著自噬的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文81.4.3納米氧化鋁暴露本項(xiàng)研究由1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)暴露組組成。將6hpf的對(duì)照組置于斑馬魚胚胎培養(yǎng)基中，每日更換胚胎培養(yǎng)液一次。各實(shí)驗(yàn)組暴露于不同濃度（0、6.25、12.5、25.0、50.0、100mg/L）的納米氧化鋁懸濁液中，每天更換新的納米氧化鋁懸濁液一次。實(shí)驗(yàn)在28.5℃恒溫孵育箱中進(jìn)行，光/暗循環(huán)14/10小時(shí)。每12h檢查各組胚胎發(fā)育情況，及時(shí)取出卵凝結(jié)的胚胎和死亡幼體。120hpf停止暴露納米氧化鋁。每個(gè)暴露劑量組和對(duì)照組分別選取70顆魚卵進(jìn)行培養(yǎng)，6月齡時(shí)，排除生長(zhǎng)過(guò)程中一些不可控因素導(dǎo)致的個(gè)別斑馬魚的死亡影響，每組剩余約60條成魚，這些成年魚被用于檢測(cè)斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力損傷及其機(jī)制。在斑馬魚成魚6、9和12月齡時(shí)檢測(cè)各種實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，包括：腦鋁含量（Alcontentinbrain）、自發(fā)運(yùn)動(dòng)（locomotoractivity）、探索運(yùn)動(dòng)（exploratoryactivity）、學(xué)習(xí)記憶能力（learningandmemory）、神經(jīng)遞質(zhì)（neurotransmitters）、氧化應(yīng)激（oxidativestress）、神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)（neuralcellscount）、超微結(jié)構(gòu)（ultrastructuralstructure）、基因表達(dá)（geneexpression）。所有的行為測(cè)試都在上午9:00到下午5:00之間進(jìn)行[45]，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。圖1納米氧化鋁暴露斑馬魚胚胎后對(duì)成年斑馬魚各種指標(biāo)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Figure1DiagramoftheexperimentaldesignusedtotestadultzebrafishaftertreatedzebrafishembryoswithAl2O3-NPs.

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文11間，每條斑馬魚都被單獨(dú)放置在T迷宮中測(cè)試。斑馬魚的行為由攝像機(jī)記錄，并由EthovisionXT10軟件分析。實(shí)驗(yàn)測(cè)試包括3個(gè)階段：（1）斑馬魚對(duì)T迷宮進(jìn)行為期4天的適應(yīng)階段（habituation），以適應(yīng)新環(huán)境。在適應(yīng)階段，所有斑馬魚都被放入T迷宮中，但數(shù)量每天逐漸減少（16、8、4和1），直到每條魚被單獨(dú)放入T迷宮中并自由游動(dòng)。（2）為期4天的訓(xùn)練試驗(yàn)（trainingtest）。訓(xùn)練試驗(yàn)旨在通過(guò)食物刺激，訓(xùn)練斑馬魚出現(xiàn)在食物獎(jiǎng)勵(lì)區(qū)，并給予食物獎(jiǎng)勵(lì)，培養(yǎng)斑馬魚的聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力[51]。在訓(xùn)練試驗(yàn)過(guò)程中，將每條魚放在T迷宮的起始區(qū)域，30秒后釋放，讓斑馬魚在T迷宮中探索4分鐘。潛伏期定義為斑馬魚從起始區(qū)域游到EC區(qū)所需的時(shí)間。在訓(xùn)練期間，如果斑馬魚在4分鐘的測(cè)試時(shí)間內(nèi)沒有出現(xiàn)在EC區(qū)，它將被引導(dǎo)到EC區(qū)，并允許它在其中停留1分鐘。訓(xùn)練測(cè)試從每天早上9:00開始[45]，連續(xù)4天每天1次。（3）在最后一次訓(xùn)練試驗(yàn)的第2天進(jìn)行記憶能力測(cè)試試驗(yàn)，以評(píng)估記憶能力。在此階段，所有斑馬魚被單獨(dú)放入同一個(gè)T型迷宮中游動(dòng)4分鐘，但不以食物作為獎(jiǎng)勵(lì)。分析了斑馬魚在EC區(qū)的累計(jì)停留時(shí)間。具體實(shí)驗(yàn)流程（如圖2）圖2T迷宮實(shí)驗(yàn)箱及T迷宮實(shí)驗(yàn)流程圖Figure2.T-mazeapparatusexperimenttankandflowchartofT-mazetest.

2.1 氧化鋁納米顆粒的表征 將納米氧化鋁懸濁液超聲 30 min 混勻，然后用透射電子顯微鏡檢測(cè)。通過(guò)圖像分析軟件分析納米氧化鋁顆粒懸濁液的透射電鏡結(jié)果，懸濁液中的納米氧化鋁顆粒顯示呈圓形，并沒有明顯的聚集，平均粒徑為（20.90±9.51）nm ，如圖3。采用納米粒度儀對(duì)納米氧化鋁懸濁液進(jìn)行分析，結(jié)果表明：納米氧化鋁的平均水合粒徑為（86.89±10.87）nm，平均 Zeta 電位為（49.43±2.21）mv。
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